Geelisamba kõrgus L= 29,5 cm Kolonni sisediameeter 2,1 cm ( r= 1,05 cm) Vajalikud arvutused tööks Kogumaht Vt= Sp * L Sp= r2 Vt= 3,14 * (1,05)2 * 29,5 = 102 cm3 Geelimaatriksi maht Vg= k* Vt Vg= 0,1* 102 = 10,2 cm³ Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg Vxmax= 102-10,2= 91,8 cm3 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/ 2 n= 91,8/246 katseklaasi Elueerimispuhver: 0,15 M NaCl; 20 mM Tris/HCl; pH= 7,5 Lahutatava segu koostis: dekstraansinine 3 mg/ml, müoglobiin 6 mg/ml, DNP- aspartaat 0,3 mg/ml Segu komponentide lahutamine kolonnis 1. Avasin alumise kraani ja lasin voolutil kolonnist tilkuda väiksesse keeduklaasi kuni vooluti oli mõne mm kõrgusel geeli nivoost, jälgides, et kolonn kuivaks ei jookseks. 2. Sulgesin kolonni väljavooluava ning doseerisin pipetiga geeli pinnale 1 ml uuritavat proovi. 3. Järgmiseks lisasin tilkhaaval voolutit, et proov imenduks geeli, kuid ei lahustuks voolutis. 4
Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg => 83,41-8,341 = 75,069 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/2 => 42,84/2 = 37,5 Katseklaasistatiivi asetati 38 katseklaasi nummerdatult. Seejärel avati kolonni väljavooluava ja reguleeriti kiirus optimaalseks (2 ml fraktsiooni kogumiseks kulub 2-3 minutit). Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, suleti kolonni väljavooluava ja kolonni sisestati pipetiga 0,5 ml uuritav proov, mis koosnes dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP- aspartaadist. Seejärel lisati vooluti, mis tagas, et uuritava proovi imendumise geeli. Kui proov oli imendunud, siis lasti voolutil tilkuda kolonni ühtlase kiirusega. Uuritavas segus olid kõik komponendid värvilised, seega oli komponentide lahutamine visuaalselt jälgitav. Senikaua, kuni kolonni alaossa pole veel jõudnud kõige kiiremini liikuv komponent, väljub kolonnist puhas vooluti, seda ei pea 2 ml fraktsioonidena koguma, kuna see poleks otstarbekas
elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiga koguda iga fraktsioon umbes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin automaatpipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. · Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiks koguda iga fraktsioon ubmes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. · Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t) Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi
L=32,5 cm. d=1,9 cm. · Arvutan täidise kogumaht Vt . · Arvutan geelimaatriksi maht Vg . · Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml. n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42 · Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. · Voolutuslahus:Dekstraansinine,Müoglobiin,DNP-Aspartaat.Kasutasin automaatpipetti mahuga 0,5 ml. · Kolonni pinnal olev eluent kogun seisukolbi. Segu komponentide lahutamine: Avan kolonni väljavooluava. Täidise lahus hakkab keeduklaasi tilkuma. Reguleerin kolonni voolukiirus piiridesse 0,7-1,0 ml/min. Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan kolonni väljavooluava . Uuritav segu: 1.segu: Dekstraansinine (sinine), müüoglobiin (punane), DNP-aspartaat (kollane). Proovi sisestamine:
Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Kolonni elueerimine Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 42,165/2≈21. Võtsin 21 kaliibritud katseklaasi Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi
Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Kolonni elueerimine Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
Biokeeemia laboritöö No 2.1 Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil. Õpperühm: YAGB21 Töö teostaja: Alexander Kirichuk Õppejõud: Tiina Randla ' Õppejõu eelnevad märkused: ,,Töös esineb kohati konarusi, osalt seotud võõrkeeles suhtlemise probleemidega, osalt lihtsalt lohakusvigu. Näiteks uuritavas segus sisaldub DNP, mitte DNAaspartaas. Lisaks, iga protokolli lõpus peab olema tulemuste analüüs. Antud juhul võiks vast veidi materjali ümber struktureerida ja paar täiendavat lauset juurde kirjutada" Teoreetilised alused: Geelkromatograafia kromatograafia meetod, mille põhjuseks on lahuses sisaldavate ainete lahutamine nende moleekulmassi suuruse järgi. Põhiliselt kasutatakse erinevate biomolekulide lahutamiseks orgaanilistest lahustest.
meetod, mis baseerub segus olevate ainete molekulmasside erinevusele.Geelkromotograafias viiakse protsess läbi kinnises süsteemis-kolonnis, mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurjusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensiooniga. Geelkromotograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist,agaroosist või polüakrüülamiididst. Kolonni lastakse mingi segu(minu segu koosnes: dekstraansinisest,müoglobiinist, DNP-aspartaadist). Kolonni alumisse ossa pannakse klaasvill(takistus).Kogu töö põhimõte on selles, et kolonnist väljuvad ained oma molekulmasside järgi, see tähendab, et molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, tulevad kolonnist läbi esimesena. Kõige väiksemad molekulid aga takistuvad pooridesse, ning väljuvad geelist viimastena.Katse käigus pidi lisama kolonni pidevalt elueerimisvedelikku (kasutasin
Maksimaalne elueerimismaht selline elueerimismaht, mille juures kolonnist väljuvad ka need molekuli, mille molekulid täielikult diffundeeruvad geeli pooridesse (=). Aineid, mille molekuli suudavad täielikult diffundeerida geeli pooridesse ja mille antud kolonnis on teada, iseloomustatakse liikuvusteguriga : Selle värtusedjäävad vahemiku 0...1 Töö käik 1. Proovi andmed: =0.5 ml. Koostis: Dekstraansinine (6 mg/ml), Müoglobiin (6 mg/ml), DNP-aspartaat (0.3mg/ml), proovi lahusti ja eluent NaCl lahus. 2. Märgin ära kolonni andmed: geel on Sephadex G-75, koeffitsient k=0.1, geelisambla kõrgus L=27.4 cm, diameeter d=1.9 cm. 3. Arvutan vajalikud mahud: ; ; 4.Arvutan fraktsioonide üldarv: n= (tegelikult 29-s fraktsioonis oli nii vähe elueerivat ainet, et sellega ma lõpetasin fraktsioonide kogumist). 5. Asetan katseklaase statiivi ja nummerdan neid. 6
Pundumistegur k 0,1 Täidise kõrgus L 31,5 cm Kolonni sisediameeter d 1,8 Täidise kogumaht ( ) Geelmaatriksi maht Maksimaalne elueerimismaht Fraktsioonide üldarv Dekstraansinine Uuritav segu Müoglobiin DNP-aspartaat pH 7,5 Elueerimislashus 0,05 M Tris/HCl 0,1 M NaCl Laine- Fraktsiooni Eluaadi Optiline pikkus järjekorra maht V tihedus (nm) nr (ml) Ühendfrakt. 23,5 0 670 1 25,5 0,025
mõõta. · Saadud tulemustest koostatakse katseandmete tabel ja selle alusel kromatogramm. Kolonni iseloomustavad parameetrid · Geel: Sephadex G 75 , fraktsioneermispiirkond 3000 80000 Daltonit · Geeli pundumistegur: k = 0,1 · Täidise kõrgus L = 31.5 cm · Kolonni sisediameeter: d = 2,1 cm Proovi komponendid · Dekstraalsinine (6mg/ml) · Müoglobiin (6mg/ml) · DNP aspartaat (0,6 mg/ml) Mõõtmis- ja arvutamistulemused 1. Kolonni täidise maht Vt 2. Geelmaatriksi maht Vg 3. Kolonni maksimaalne elueerimismaht Vx,max 4. Fraktsioonide üldarv n. 5. Mõõtmistulemuste tabel Optiline Fraktsiooni Elueerimisma tihedus number ht V, ml ,A
Tulemuste põhjal koostati kromatogramm. Tulemused ja nende analüüs Täidise mark: SEPHADEX G-75 Pundumistegur k = 0,1 Täidise kõrgus L = 32,5 cm Kolonni diameeter d = 2,1 cm r =1,05 Täidise kogumaht: Vt= ·r2·L = 3,14 · 1.052 · 32,5 = 112,5 cm3 Geelmaatriksi maht: Vg= 0,1 · 112,5 = 11,25 cm3 Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 112,5 11,25 = 101,26 cm3 Fraktsioonide üldarv: n=101,26 : 2 = 50, 63 51 Uuritav segu: Dekstraansinine 3mg/ml Müoglobiin: 5mg/mol DNP-aspartaat: 0,3 mg/mol Elueerimislahus: pH= 7,4 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl Fraktsiooni nr Lainepikkus, nm Elueerimismaht V, Optiline tihedus, ml A Ühendatud fraktsioon - 23 0 1 670 25 0 2 670 27 0,032
Tulemused Kolonni parameetrid · Täidis: Sephadex G-75 · Pundumistegur: k = 0,1 · Täidise kõrgus: L = 32cm ja diameeter: d = 1,7cm · Täidise kogumaht: Vt = 72,63cm3 · Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 65,357cm3 · Fraktsioonide arv n = 25 Kromatogramm · Teades, et komponentideks olid: 1. Dekstraansinisest 3mg/ml, Mr = 2 · 106 2. Müoglobiinist 6mg/ml, Mr = 1,7 · 104 3. DNP aspartaadist 0,3mg/ml Kuna sinine desktraansinine voolas läbi kolonni kõige kiiremini võib järeldada, et tema molekulmass on suurim. Kahjuks ma DNP aspartaadi molekulmassi ei tea, mistõttu on keeruline oletada, kumb väljus kolonnist enne, kes müoglobiin või DNP aspartaat. · Eluaadi maht dekstraansinise kõrgema kontsentratsiooni hetkel Vxmin = Vv = 31,5ml · Kuna ma OPN aspartaadi molekulmassi ei tea siis oletan, et ONP aspartaadi molekulmass on
maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg = 75,407,54 = 67,86 ml. Fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; n = V xmax/2 = 67,86/2 = 33,93. Avasin kolonni vooluava ning täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt mööda kolonni liikuma. Vedeliku tasemel lasin langeda kuni täidise pinnani, sulgesin kolonni vooluava ning panin peale uuritavat proovi, mis koosnes: dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP-aspartaadist. Dekstraansinine väljub minimaalse väljumismahuga ning tänu sellele on komponentide lahutumine paremini jälgitav. Kolonni voolutamine Võtsin uuritavat proovi 0,5 ml ning lasin sel voolata geeli pinnale võimalikult ühtlaselt. Seejärel avasin voolutusava ning kuni alaossa jõudis kõige kiiremini liikuv osa, milleks on dekstraansinine, väljus kolonnist puhas vooluti, mille kogusin ühendatud fraktsioonina (16,75 ml). Seda kogusin sinnamaani, kuni nägin kolonnis, et
Kromatogramm. Kõige esimesena väljus kolonnist dekstraansinine , selle osakesed olid väga suured ja ei mahtunud geeli pooridesse. Dektraansinine on nendest kolmest ainest kõige väiksema molekulmassiga. Dekstraansinise kontsentratsioon uuritavas lahuses oli kõige väiksem. Teisena väljus kolonnist müoglobiin , mille osakesed difundeerusid geeli pooridesse osaliselt. Müoglobiini kontsentratsioon uuritavas lahuses oli kõige suurem. Viimasena väljus kolonnist DNP-aspartaat , sest tema osakesed difundeerusid täielikult geeli pooridesse, mistõttu tema osakesed liikusid kolonnis kõige aeglasemalt. DNP-aspartaat on nendest kolmest ainest kõige suurema molekulmassiga. Arvutuslikult tuli kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima kontsentratsioonida fraktsiooni eluaadi maht , mis on veidi suurem, kui katseliselt saadud tulemus
difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm r= 0,8 cm Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP-aspartaat 0,3mg/ml Arvutasin välja: Vt = r2 * L= 3,14 * 0,64 * 25,5 = 51,27 cm3 Vg= k*Vt = 0,1 * 51,27 = 5,127 ml Vx max = Vt Vg = 51,27 5,127 = 46,143 ml N= Vx max /2 = 46,143 /2 = 23,1 tk Pärast ettevalmistuste tegemist avada ettevaatlikult kolonni voolutusava ning kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, siis taas sulgeda kolonni väljavooluava. Kolonn on valmis proovi sisestamiseks.
NB! Õhk ei tohi tungida geelikihti! 4. Kasutan kalibreeritud mõõtpipetti ja viin 1 ml uuritavat proovi kolonni. 5. Lasen proovil tilkuda geeli pinnale nii, et see jaotuks seal võimalikult ühtlaselt. NB! Samal ajal on väljavooluava suletud! Praktikumis uuritavas ainete segus on kõik ained värvilised ja segu komponentide lahutamine on visuaalselt jälgitav. Uuritava segu sisaldus: dekstraansinine + müoglobiin + DNP-aspartaat KOLONNI VOOLUTAMINE: 1. Avan väljavoolu kolonnist 2. Hakkan koguma eeljooksu (puhas vooluti), enne kui kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent (dekstraansinine). 3. Kui proov on täidisesse sisenenud, viin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikese koguse (0,5-1 ml) eluenti 4. Lasen eluendil täidisesse imbuda. 5. Kordan seda protsessi väikeste kogustega seni, kuni kogu uuritav proov on kolonni sisenenud 6
Nüüd oli kolonn valmis proovi sisestamiseks. Proovi sisestamine Võtsin pipetiga 1 mL uuritavat proovi ja viisin selle kolonni. Selleks juhtisin pipeti otsa vastu kolonni seina ja lasin proovil voolata geeli pinnale nii, et geel saaks võimalikult ühtlaselt kaetud. Uuritav segu Uuritav segu koosnes kolmest erineva molekulmassiga komponendist. Uuritava segu koostisosad: 1) Dekstraansinine, 3 mg/mL 2) Müoglobiin, 6 mg/mL 3) DNP-aspartaat, 0,3 mg/mL Kolonni voolutamine Kui olin proovi viinud geeli pinnale, siis avasin väljavoolutoru ja hakkasin eluaati koguma alguses ühendatud fraktsioonina kuiva kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda. Kordasin sama asja väikese eluendi kogusega veel teinegi kord ja siis viisin juba geeli pinnale nii palju eluenti, et moodustus u 5 cm kõrgune kiht.
n= 2ml 79, 8 ml n= 2 ml = 39,9 = 40 Seejärel lasen eluenti (0,15 M NaCl lahus) kolonnist keeduklaasi, kuni eluendi tase kolonnis langeb täidise piirini. Pean silmas, et vedelikunivoo alla täidise piiri ei langeks, muidu satub geelikihti õhk, mis võib katsetulemusi mõjutada. Hoides kolonni väljavooluava suletuna, pipeteerin 0,5 ml uuritavat ainet ühtlaselt geeli pinnale ning lasen sellel valguda läbi geeli. Uuritav lahus sisaldab dekstraansinist, müoglobiini ja DNP-aspartaati (vedelik on algul rohelist värvi). Seni, kuni dekstraansinine (mis on kõige kiiremini liikuv aine) jõuab kolonni alaossa, kogun vooluti (seda pidevalt lisades) ühendatud fraktsioonina keeduklaasi. Mõõdan selle koguse sobiva mõõtsilindriga ära ning saan tulemuseks Vüf=20,65 ml. Kui sinise värvusega dekstraansinine on jõudnud kolonni alaossa, võtan ühendatud fraktsioonina kogutud keeduklaasi alt ning hakkan fraktsioone 2 ml kaupa katseklaasidesse koguma
põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldas praktikas uuritav segu dekstraansinist (3mg/ml), mis elueerus minimaalse väljumismahuga ja mille järgi sain teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2*106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Lisaks sisaldas uuritav segu Müoglobiini (6mg/ml), mille molekulmass on 16800 Da ja DNP- aspartaati (0,3 mg/ml). Kolonni voolutamine Enne kõige kiiremini liikuvat komponenti (dekstraansinist) kolonnis väljuva puhta vooluti kogun ühendatud fraktsioonina, milleks asetan enne voolutamise algust kolonni väljalaskeava alla 100 ml kuiva kolvi. Olnud proovi eelkirjeldatud viisil geeli pinnale kandnud, avasin väljavoolu kolonnist ja hakkasin eluaati koguma ülalnimetatud kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin
külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga tähtis inimese kehas, kuna ta on skellet- ja südamelihase hapnik-siduv valk. Kolmas komponent, millel on kõige väiksem molekulmass oli DNP aspartaat, so asparagiinhappe dinitrofenüülderivaat (0,6 mg/ml). Seda kasutatakse selleks, et ainete lahutamise piir oli nähtav, kuna DNP-aspartaadi lahusel on kollane värv. Tema neeldusmaksimum on lainepikkusel 360 nm. Kolonni voolutamine. Kui kõik uuritav segu jõuab geeli sisse, saab lisada voolutit 4-5cm kõrgusega ja avata väljavooluavat. Ning mõne aega pärast, segu hakkab lahutama: allpool on dekstraansinine, keskel müoglobiin ja üleval on kollase värvusega DNP-aspartaam
R f = max V x - V xmin 50 - 40 Rf = 96 - 40 =0,178 JÄRELDUS. Töö õnnestus enam vähem hästi, ainete piir oli üpriski eristatav. Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest. Esimesena väljus kõrgmolekulaarne dekstraansinine, peale seda müoglobiin ja seejärel väikse Mr-ga DNP-aspartaat. Sahharoos oleks tõenäoliselt väljunud umbes ühel ajal DNP- aspartaadiga kuna mõlemad on madalmolekulaarsed. Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramiseks mõõdetud kõrguse ja diameetri leidmisel tehtud veast. Suurema diameetri ja kõrguse korral oleks teoreetiline Vxmax tulnud ligilähedane saadud tulemusega.
52 - 42 Rf = 96 - 42 =0,185 JÄRELDUS. Töö õnnestus enam vähem hästi, ainete piir oli üpriski eristatav. Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad läbi kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest. Esimesena väljus kõrgmolekulaarne dekstraansinine, peale seda müoglobiin ja seejärel väikse Mr-ga DNP-aspartaat. Sahharoos oleks tõenäoliselt väljunud umbes ühel ajal DNP-aspartaadiga kuna mõlemad on madalmolekulaarsed. Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramiseks mõõdetud kõrguse ja diameetri leidmisel tehtud veast. Suurema diameetri ja väiksema kõrguse korral oleks teoreetiline Vxmax tulnud ligilähedane saadud tulemusega.
R f = max V x - V xmin 45,5 - 27,5 Rf = = 0,36 77,5 - 27,5 Järeldus: Töö õnnestus enam vähem normaalselt. Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest. Esimesena väljus kõrgmolekulaarne dekstraansinine, peale seda müoglobiin ja seejärel väikse Mr- ga DNP-aspartaat. Sahharoos oleks tõenäoliselt väljunud umbes ühel ajal DNP- aspartaadiga kuna mõlemad on madalmolekulaarsed. Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramiseks mõõdetud kõrguse ja diameetri leidmisel tehtud veast.
tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl 2 Mõõtmistulemuste tabel Fraktsiooni number Elueerumismaht V (ml) Optiline tihedus (A) Ühendatud fraktsioon 25 0 1 27 0,042 2 29 0,2026 3 31 0,1868
Sinised fraktsioonid mõõdetakse lainepikkusel 670nm, pruunid lainepikkusel 410nm ja kollased lainepikkusel 360nm. Koostatakse katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine (molekulmass 2 000 000 Da), mis ei läbinud geeli poore ja väljus minimaalse elueerimismahuga. Teisena väljus müoglobiin (molekulmass 17 800 Da), mis osaliselt difundeerus geeli. Viimasena väljus DNP-aspartaat (molekulmass 299 Da), millel on võrreldes teistega väga väike molekulmass ning seetõttu difundeerus täielikult geeli pooridesse. Eluaadi maht kuni deksrtaansinise kõrgeima konstentratsiooniga kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli Vxmin = 20,75 ml Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli Vx = 28,75 ml Eluaadi maht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli Vxmax = 57,75
Vxmax fraktsiooni väljumiseni. Vxmin Dekstraansinise elueerumismaht on võrdne kolonni vaba mahuga, kuna tema molekulmass on 200 kDa ning ta ei mahu geeli pooridesse ja liigub pooridevahelisel alal, kuivõrd antud geeli lahutuspiirkond on .... 3000-80000 Da. Dekstraansinine väljus esimesena, kuna tema molekulaarmass on suurim ja ta ei mahtunud geeli pooridesse. DNP-aspartaat on väikseima molekulaarmassiga ning ta difundeerus täielikult pooridesse ja läbis seetõttu kolonni kõige aeglasemalt. Kuna geelkromatograafia põhimõtte on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi, siis järeldan ka, et ma ei tegelenud praktikumis mustkunstiga ning sain ootuspärased tulemused, kus kõige suurema molekulmassiga aine väljus esimesena ning kõige väiksema molekulmassiga väljus viimasena
Täidise kõrgus L = 33 cm Täidise diameeter d = 1,8 cm ; r = 0,9 cm Täidise kogumaht Vt = r 2 L = 0,9 2 33 = 83,98cm3 Geelmaatriksi maht Vg = k Vt = 0,1 83,98 = 8, 40cm3 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt - Vg = 83,98 - 8, 40 = 75,58cm3 Fraktsioonide üldarv V max 75,58 n= x = = 37, 78 38 2 2 Voolutuslahuse koostis 50 mMTris-HCl 150 nM NaCl pH = 7,5 Uuritava proovi koostis Dekstraansinine (sinine) Müoglobiin (pruun) DNP-aspartaat (kollane) Töö kolonniga Kõigepealt avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et voolutuslahuse nivoo oleks võrne täitegeeliga. Samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirus reguleerimisklambri abil õigeks (soovitav voolukiirus 0,7-1,0 ml/min, millele vastab 1 tilk nelja sekundi jooksul). Voolutuslahus kogutakse väiksesse keeduklaasi ja visatakse pärast minema. Seejärel lisatakse kolonni uuritav proov. Pipetti võetakse 0,5 ml uuritavat proovi (koostis kirjas eespool)
25 69,5 0,484 360 26 71,5 0,186 360 27 73,5 0,056 360 28 75,5 0,033 360 C. Kromatogrammilt: Komponentide elueerumisprofiilid: Dekstraansinine (: A = 0,400; eluaadi maht V = 25,5 ml Müoglobiin (: A = 3,0; eluaadi maht V = 33,5 ml DNP-aspartaat (: A = 1,364; eluaadi maht V = 65,5 ml Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, mis tõestab, et sellel on kõige suurem molekulmass. Tänu sellele ei difundeerunud ta geeli pooridesse, vaid väljus kolonnist graanulite vahelt minimaalse elueerimismahuga, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vxmin = 25,5 ml.
valmis proovi sisetamiseks. 1.4 Proovi sisestamine Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin pipetti. Viisin 0,5 ml uuritavat proovi kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina. Proovil lasksin voolata geeli pinnale nii, et see jaotuks võimalikult ühtlaselt. 1.5 Uuritavad segud Uuritav segu koosnes järgnevatest ainetest: Dekstraansinine ( 6 mg/ml ) Müoglobiin ( 6 mg/ml ) DNP aspartaat ( 0,6 mg/ml ) 2.4 Kolonni voolutamine Kui proov on täidisesse sisenenud, viin pipetiga geeli pinnale väikse koguse voolutuslahust ja lasen täidisesse imbuda. Kordan seda nii kaua, kuni kogu uuritava proov on kolonni sisenenud ja siis võib geeli pinnale kanda suurema hulga voolutit. Kui esimene värviline riba ( dekstraansinine ) läheneb kolonni põhjale, siis eemaldab kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja hakkan koguma eluaati 2ml kaupa
graanulitevahelise mahuga. Ta väljus esimesena, sest tema molekulid on liiga suured ning ei mahu geeli pooridesse, tema molekulmass on suurim. Eluaadimaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooga fraktsiooni väljumiseni on Vx;min=Vv=26ml(ühendatud fraktsioon)+6ml=32ml. Järgmisena väljus kolonnist müoglobiin (teine kõver kromatogrammil) Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx=32+24=56ml. Kolmandana väljus DNP-aspartaat (kolmas kõver) ning see on kõige väiksema molekulmassiga aine, ta difundeerus kõige rohkem geeli pooridesse, väljus maksimaalse elueerimismahuga. Eluaadi maht DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni:Vx;max= 56+34=90ml. D. Viimasena väljunud komponendi elueerimismahtu võrreldakse arvutusliku Vx;max väärtusega. Arvutuslikult sain, et Vx;max=95.4ml. Katse tulemusel sain aga 90 ml. On näha, et need on natukene erinevad
Reguleerida tuli ka voolukiirus 0,5-0,8 ml/min. Hiljem, kui siniselt värvunud molekulid olid geelist läbi tulnud, võis kiirust lisada. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 0,5ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. 4. Lisasin puhverlahust, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused:
Elueeritud segus oli: 1. Dekstraansinine - absorbeerib lainepikkusel 670 nm. Sinise värvusega aine, mis väljub esimesena, sest dekstraansinine on kõrgmolekulaarne (suured molekulid), mille tulemusena molekulid ei mahu geeligranulite pooridesse ja liikuvad kiiresti nende vahel. Kromatogrammi järgi elueerimismaht on Vx min = 24 ml 2. Teisena väljus Lysozyme, mis absorbeerib lainepikkusel 280 nm Vx = 48 ml 3. DNP - Aspartaat - absorbeerib lainepikkusel 360 nm. Kollase värvusega aine väljub viimasena, kuna temal on kõige väiksem molekulaarmass ja molekulid hästi mahuvad pooridesse, mis pidurdavad nende liikumist. Vxmax = 72 ml Liikuvusteguri Rf väärtus: V x -V min x 48-24 Rf = max min = =0,5 V x -V x 72-24 Järeldus
lainepikkusel 625 nm. Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga tähtis inimese kehas, kuna ta on skellet- ja südamelihase hapnik-siduv valk. Kolmas komponent, millel on kõige väiksem molekulmass oli DNP aspasrtaamaspartaat, so asparagiinhappe dinitrofenüülderivaat t(0,6 mg/ml) Aspartaami kasutatakse suhkru asendajaks. Tema molekulmass on 294,301 g/mol Aspartaami lahusel on kollane värv. Tema neeldusmaksimum on lainepikkusel 360 nm. Kolonni voolutamine.
Täidise kõrgus 22,2 ja sisediameeter 1,8 Arvutatud täidise kogumaht 56,46 Arvutatud maksimaalne elueerimismaht 50,89 Arvutuslik fraktsioonide üldarv 25 B. C. Graafikult on näha kolme tõusu ja langust, mis näitavad, et aine konts. kolonnist väljumisel tõuseb, saavutab haripunkti ja langeb, kuni lõpuks on kogu aine kolonnist väljunud. Ained jagunesid geelis vastavalt molaarmassile. Dekstraansinine, mille molaarmass on tunduvalt suurem, kui müoglobiinil ja DNP-Aspartaadil, väljus kolonnist esimesena. Kolmandana elueerus DNA-Aspartaat, mille molekulid on piisavalt väikesed, et täielikult geeli pooridesse siseneda ning on seetõttu maksimaalse elueerimismahuga. D. E.Rf= Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin=
Oluline oli mitte kolonni lasta kuivaks joosta, sest muidu tungib õhk geelikihti. Kasutatud kolonnil oli automaatselt reguleeritud kiirus. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 1ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. 4. Kogusin eelfraktsiooni mõõtkolbi, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogutud eelfraktsiooni mahu mõõtsin mõõtsilindri abil. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende
0 40. Pärast aktsioonipotentsiaali tekkimist taastub neuroni puhkeseisundile omane membraanipotentsiaal K+ ioonide väljumise arvel 41. Membraanipotentsiaalist sõltuvate Na+ kanalite puhke- (refraktsiooni) periood on oluline Aktsiooni potentsiaali ühesuunaliseks liikumiseks 42. Kuidas on võimalik vältida H+ATPaasi funktsioneerimisega kaasnevat membraani hüperpolariseerumist? Nii katioonide impordi kui anioonide ekspordiga TEST 10 1. 2,4 DNP (2,4 dinitrofenool) teeb mitokondrite membraanid prootonitele läbitavaks ja kaotab prootonite kontsentratsiooni erinevuse membraani eri pooltel. Mis juhtub loomaga, kellele on süstitud DNP lahust mitmel korral eksperimendi jooksul? Sünteesib vähem ATP-d 2. Rasvhape oksüdeerub 10-ks AcCoA molekuliks. Kui palju GTP/ATP-d tekib nendest vahetult tsitraaditsükli reaktsioonide tulemusel? 10 3
Exercise and ambulation. In: Smith SF, Duell DJ, Martin BC, Aebersold M, Gonzalez L, eds. Clinical Nursing Skills: Basic to Advanced Skills. 9th ed. New York, NY: Pearson; 2017:chap 13. Smith SF, Duell DJ, Martin BC, Aebersold M, Gonzalez L. Perioperative care. In: Smith SF, Duell DJ, Martin BC, Aebersold M, Gonzalez L, eds. Clinical Nursing Skills: Basic to Advanced Skills. 9th ed. New York, NY: Pearson; 2017:chap 26. Elsa Wuhrman, MS, FNP; Maureen F. Cooney, DNP, FNP. Acute Pain: Assessment and Treatment. Medscape; January 3, 2011. J.R. Balentine, DO, FACEP. Constipation in Adults. Medscape; August 31, 2017. Lane BR, Canter DJ, Rini BI, Uzzo RG. Cancer of the Kidney. In: Devita VT Jr, Lawrence TS, Rosenberg SA, eds. DeVita, Hellman, and Rosenberg's Principles and Practice of Oncology. 10th ed. Philadelphia, PA: Wolters Kluwer Health; 2015. 865-84. Maria E Echevarria-Guanilo; Caroline L Ciofi-Silva; Silvia R Canini; Jayme A Farina Jr; Lidia A Rossi
annaabi.ee 
