Tableti valmistamine 1) Kaaluda kaalumispaberil 70-80 mg KBr 2) Viia kaalutud KBr ahhaatuhmrisse 3) Lisada sinna spaatli otsaga (~1mg) uuritavat ainet 4) Saadud segu peenestada ning segada uhmrinuia abil peeneks 5) Saadud segu viia pressvormi ühtlase kihina ( kahe ketta vahele, peegelpinnad vastamisi) 6) Pressida rõhu all tabletiks( 10 t), kui on saavutatud vastav rõhk, siis oodata 30 s ning avada kraan 7) Saadud tablett asetada tabletihoidjasse 8) Tabletihoidja asetada spektrofotomeetri proovikambrisse 9)Mõõta spekter ning määata korrelatsioontabelite abil neeldumismaksimumidele vastavad sidemete võnkumised 10) Pesta tableti tegemiseks kasutatud vahendid( v.a tabletihoidja) kraani all veega ning kuivatada hoolikalt 11) Tabletihoidja puhastada niiske vatiga ja kuivatada Vedela aine spektri mõõtmine 1) Puhta vedeliku spektri mõõtmiseks kasutada KBr plaate, mis lasevad IP-kiirgust läbi 2) NB
ühtlase massi saavutamiseni. Siis lisasin sinnasamasse üksikute portsjonitega kaupa veevaba Na2SO4, et vett sisuda. Jätkasin massi hõõrumist. Järgnevalt ekstraheerisin karotenoidid petrooleetriga ning filtrisin ekstrakti. Karotenoidide kvantitatiivseks määramiseks tuli ekstraktsiooni värske ekstrahendi portsjonitega korrata kuni värvitu ekstrakti saamiseni. Neeldumisspektrite võtmine ja analüüs Spekter mõõdetakse vahemikus 350-600 nm, kasutades võrdluslahustina puhast lahustit. Spektrofotomeetri isekirjutilt sain uuritava lahuse neeldumisspektri. Neeldimismaksimumid paiknesid järgnevatel lainepikkustel: 465,5 nm/ 1,247 A 436,5 nm/1,379 A 415,0 nm/0,994 A Puhta -karoteeni vastavad lainepikkused on: 482 nm; 451 nm; 425 nm. Puhta - karoteeni vastavad lainepikkused on 475 nm; 445 nm; 420 nm. Minu uuritava proovi neeldumismaksimumide lainepikkused on lähemal pigem - karoteeni vastavatele väärtustele, siis arvutan -karoteeni sisalduse proovis. Kuna 436,5
Soola lisamise võib lõpetada, kui on moodustunud kuiv, pulbriline mass. Järgmisena tuleb karotenoidid petrooleetriga proovist välja lahustada ning ekstrakt ära filtrida. Lõpuks tuleb kindlaks määrata ekstrakti kogumaht, minu katses oli selleks 10 ml. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350-650 nm, võrdluseks kasutatakse puhast lahustit (petrooleeter). Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega näidatakse ära ja märgitakse protokolli need lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid ja neile vastavad optilise tiheduse väärtused. Kolm neeldumismaksimumi: 1. =502,0 nm 0,340 A 2. =471,0 nm 0,418 A E1%= 3450 3. =445,5 nm 0,306 A Võrrelda uuritava lahuse neeldumisspektril esinevate neeldumismaksimumide asukoti
puhastatav aine lahustub kuumas lahustis, puhastatav aine on lahustumatu või nõrgalt lahustuv külmas lahustis, lisandid on kas täielikult lahustuvad külmas lahustis või täielikult mittelahustuvad kuumas lahustis. Ainete sulamistemperatuuride määramine: · Aine sulamistemp on temp, mille juures aine tahke ja vedel faas on normaalrõhul tasakaalus. · Sulamistemperatuur iseloomustab hästi ainet ja tema puhtusastet. Ainete spektrofotomeetriline uurimine: · Spektrofotomeetri abil on võimalik uurida, kuidas neelab uuritav aine elektromagnetkiirgust erinevatel lainepikkustel. · Neeldumisspekter võimaldab aineid identifitseerida ja hinnata nende puhtusastet (erinevatel ainetel on erinev neeldumisspekter). · Lisaks ainete identifitseerimisele võimaldab neeldumisspekter määrata ka ainete kontsentratsioone. Seose aine kontsentratsiooni ja absorptsiooni (kindlal lainepikkusel) vahel annab Lambert-Beeri seadus: A = c · · b
kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan. Kui esimene värviline riba läheneb kolonni põhjale, eemaldatakse kooniline kolb ja edaspidi kogutakse kolonnist väljuvat vedelikku fraktsioonidena kaalibritud katseklaasidesse. Koonilises kolvis oli 22ml. Kogutavate fraktsioonide arv = 33 Mõõdetakse kõigi fraktsioonide optilised tihedused, reguleerides spektrofotomeetri vastavale lainepikkusele. Dekstraansinine Müoglobiin DNP-aspartaat 670nm 410 nm 360nm 0,221 0,547 0,324 0,387 1,075 0,603
FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Peroksüdaas on koostisest ka liitvalk ja selle toimel leiab aset spetsiifiliste substraatide oksüdeerumine H2O2-lt pärineva hapniku abil. Oksüdeerides, mõned substraadid anaavad värvilisi produkte. Siis saab kasutada spektrofotomeetri ning jälgida värviliste ühendite kontsentratsiooni, mis on võrdilises sõltuvuses glükoosisisaldusest. Peroksüdaas Oksüdeeritud substraat + H2O2 Taandatud substraat + 2 H2O Värvusetu Värviline Peroksüdaasi toimel oksüdeeuva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensiini derivaate. Üheks võimaliseks on o-taoliin, misse helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 630 nm
ja kalanduse uuringutes, arvestada fütoplanktoni vähenemis trendidega. Seetõttu on ookeanide ökoloogiliste muutuste uuringutes fütoplanktonil arvestatav roll, vaatamata selle väikestele mõõtmetele. Kuna klorofülli pigmentide kontsentratsiooni kaudu ookeanides saab hinnata fütoplanktoni biomassi ja produktsiooni, kasutati seda meetodit andmede kogumiseks. Lisaks laboratoorselt klorofülli sisalduse määramisele mereveest spektrofotomeetri ja fluvomeetriga, ning sateliit kaugseire kaudu, arvutati klorofülli sisaldus ka Secci kettaga mõõdetud sügavustest. Õigete tulemuste saamiseks selekteeriti välja ekslikud ja bioloogiliselt ebatavalised klorofülli tasemed, ning optilised vead põhjustatud mandrilistest ja resuspendeerunud osakestest kuni 25 meetri sügavuses vees või 1 km kaugusel rannast. Andmete koguhulga suuruseks kujunes
· Lasin sademel põhja settida ja selle kohal oleva ekstrakti kandsin teelusika abil filtrile. Ekstrakt sademe kohal oli kollane. · Kordasin eelpool kirjeldatud operatsiooni kuni sademe kohal olev ekstrakt muutus värvusetuks. · Määrasin kindlaks ekstrakti kogumahu. Ekstraheerimisel sain ekstraksi 3 ml. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs: · Täitsin klaasküveti poolenisti ekstraktiga. · Järgnes neeldumisspektri võtmine spektrofotomeetriga. · Spektrofotomeetri ekraaline joonistus uuritava lahuse neeldumisspekter, millel märkisin ära need lainepikkused, kus paiknesid iseloomulikud neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad absorptsiooni ehk optilise tiheduse täpsed väärtused. · Trükkisin neeldumisspektri välja. Spektrofotomeetri andmed: Ekstrakti optiline tihedus, ABS Neeldumismaksimumid, nm 0,309 504,0 0,5435 472,0
ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan. Kui esimene värviline riba läheneb kolonni põhjale, eemaldatakse kooniline kolb ja edaspidi kogutakse kolonnist väljuvat vedelikku fraktsioonidena kaalibritud katseklaasidesse. Koonilises kolvis oli 30ml. Kogutavate fraktsioonide arv = 46 Mõõdetakse kõigi fraktsioonide optilised tihedused, reguleerides spektrofotomeetri vastavale lainepikkusele. Dekstraansinine Müoglobiin DNP-aspartaat 670nm 410 nm 360nm 0,015 0,621 0,041 0,131 0,814 0,067 0,323 0,916 0,099 0,263 0,896 0,168
Järeldused I töö: Ensüümi kontsentratsiooni suurendamine kiirendab reaktsiooni kiirust. II töö: Substraadi kontsentratsiooni tõstes suureneb ka reaktsiooni kiirus, kuni maksimaalse kiiruse saabumiseni. Hälvete graafikut analüüsides saab järeldada, et katse ei õnnestunud 100%, kuid on küllaltki adekvaatne. Mõlema töö puhul on näha, et katsetes esinesid vead. Need võivad tuleneda ebatäpsest pipeteerimisest, spektrofotomeetri vanusest, mitte nii täpsest inkubatsiooniasjast jne.
Sama tehakse ka katse 10-ndal ja 15-ndal minutil. 4 proovidega katseklaasi jäetakse täielikuks sademe formeerumiseks 10-15 minutiks seisma. Samal ajal võetakse 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning asetatakse neile lehtrid ja filterpaberid. Kõik proovid filtreeritakse, et saada selged lahused. Minu lahuseid ei olnud vaja teist korda filtreerida tulemus oli pärast esimest filtreerimist sobiv. Edasi määratakse kõigi nelja proovi optilise tiheduse väärtused spektrofotomeetri abil. Katse andmed D280;1=0,150 D280;2=0,154 D280;3=0,219 D280;4=0,269 CTyr;1=0,024 M CTyr;2=0,025 M CTyr;3=0,034 M CTyr;4=0,043 M Esimeses katseklaasis saadud tulemus ei saanud õige olla. Nimelt oleks pidanud kõigi nelja proovi optiliste tiheduste vahe olema (enam-vähem) võrdne. Esimese katseklaasi viga võis seisneda selles, et pärast reaktsioonisegu valmimist ei segatud seda piisavalt. Graafiku tegemisel kasutan kolme järgmist tulemust: Arvutused Valem: CTyr 103 V1 V2 2 A=
Selle viisin läbi väikese lusikaga, tõstes sademe kohal olevat lahust filtrile nii, et sadet ennast filtrile ei satuks. Tegin filtreerimist mitu korda. Minul tuli ekstrakti mõõtesilindrisse 46 ml (ekstrakti kogumaht). Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Karotenoidide neeldumisspekter mõõtsin vahemikus 350-650 nm ning võrdluslahusena kasutasin puhast ektrahenti, milleks oli minu katse puhul oktaan. Töötasin klaasküvettidega. Pärast masina töövalmis sättimist joonistus spektrofotomeetri ekraanile uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega sain kindlaks määrata need lainepikkused, kus paiknesid iseloomulikud neeldumismaksimumid (max) ja maksimumidele vastavad absoptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. Trükkisin neeldumisspektri välja. Lainepikkus max Absorptsioon A (nm)
1 mg/ml) viiakse 15 ml tuubi ja lisatakse 3 ml dest.vett, saadakse lahus nr 1 kontsentratsiooniga 0.25 mg/ml II. Võetakse 2 ml lahust 1 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 2 kontsentratsiooniga 0.125 mg/ml. III. Võetakse 2 ml lahust 2 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 3 kontsentratsiooniga 0.062 mg/ml. 3. Reaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi toatemperatuuril spektrofotomeetri küvettides. Selleks võtsin kuus kuiva küvetti ja nummerdasin neid. Küvett 1: nullproov, dest.vett 250 l Küvett 2: uuritavat proovi 250 l Küvett 3: uuritava proovi paralleel 250 l Küvett 4: glükoosilahust 1 (0.25 mg/ml) 250 l Küvett 5: glükoosilahust 2 (0.125 mg/ml) 250 l Küvett 6: glükoosilahust 3 (0.062 mg/ml) 250 l Igasse küvetti lisatakse 750 l tööreaktiivi ning segatakse läbi. Fikseerisin reaktsiooni
ennast filtrile ei satuks. Korduvektraktsioon toimus kuni sademe kohal olev ekstrakt muutus värvustuks. Minul tuli ekstrakti mõõtesilindrisse 7,5 ml (ekstrakti kogumaht). Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Karotenoidide neeldumisspekter mõõtsin vahemikus 350-600 nm ning võrdluslahusena kasutasin puhast ektrahenti, milleks oli minu katse puhul heptaan. Töötasin klaasküvettidega. Pärast masina töövalmis sättimist joonistus spektrofotomeetri ekraanile uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega sain kindlaks määrata need lainepikkused, kus paiknesid iseloomulikud neeldumismaksimumid (max) ja maksimumidele vastavad absoptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. 2 Võrdlesin saadud tulemusi laborimaterjalidega, sain tulemuseks, et minu proov (porgand) sisaldas -karoteeni. Lainepikkus max
Sama tehakse ka katse 10-ndal ja 15-ndal minutil. 4 proovidega katseklaasi jäetakse täielikuks sademe formeerumiseks 10-15 minutiks seisma. Samal ajal võetakse 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning asetatakse neile lehtrid ja filterpaberid. Kõik proovid filtreeritakse, et saada selged lahused. Minu lahuseid ei olnud vaja teist korda filtreerida – tulemus oli pärast esimest filtreerimist sobiv. Edasi määratakse kõigi nelja proovi optilise tiheduse väärtused spektrofotomeetri abil. Katse andmed D280;1=0,150 CTyr;1=0,024 M D280;2=0,154 CTyr;2=0,025 M D280;3=0,219 CTyr;3=0,034 M D280;4=0,269 CTyr;4=0,043 M Esimeses katseklaasis saadud tulemus ei saanud õige olla. Nimelt oleks pidanud kõigi nelja proovi optiliste tiheduste vahe olema (enam-vähem) võrdne. Esimese katseklaasi viga võis seisneda selles, et pärast reaktsioonisegu valmimist ei segatud seda piisavalt. Graafiku tegemisel kasutan kolme järgmist tulemust: 0
Müoglobii DNP-Aspartaat 5. Kolonni voolutamine. Kuni kollonni allaosa jõuab kõige kiiremini liikub komponent (meie juhul dekstraansinine) kogume eluaadi ühendatud fraktsiooniga ühe kolbi. Pärast esimese komponentide kolonni alla jõudmisel kogume 2 ml kaupa. 6. Fraktsioonide analüüsimine. Meie töös väljendame aine kontsentratsiooni igasfraktsioois lahuse optilise tiheduse järgi. Iga aine absorbeerib erinevatel lainepikkusel. Kasutame spektrofotomeetri meetodi. 7. Koostame 3-veeruline katseandmet tabel, mis on alusel krommatogrami jaoks. Tulemused: Kasautatud kolonni paraametrid: · Täidise materjal ja mark: geel G-75. · Täidist iseloomustav tegur k : K=0,1 · Täidise kõrgus ja kolonni sisediaameter: D=1,8cm , L=32,7 · Arvutatud täidise kogumaht Vt: Vt= r2 *L = 3,14*0,9*32,7= 83,21cm3 · Arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vx max : Vg= K*Vt , Vmax =Vt-Vg Vg = 0,1 *83,21 =8,321 Vmax=83,21 -8,321 =74,89.
lasin sellel sisse imbuda. Siis kandsin geeli pinnale suurema kogus voolutuslahust, lisasin seda pidevalt vastavalt vajadusele. Avasin väljavoolu ning hakkasin koguma voolutit, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõudis kolonni alaossa. Ühendatud fraktsiooni mahu mõõtsin pärast. Alustasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Elueerimise lõpetasin, kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsisin spektrofotomeetri abil. Igal ainel oli oma neeldumismaksimum. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrdusid 0-ga ja neid polnud vaja mõõta. Tulemused: · Kolonni täidiseks on Sephadex'i G-75, iseloomustav pundumistegur k on 0,1 · Geelisamba kõrgus L=33 cm ja diameeter d=1,6 cm · Täidise kogumaht Vt=L** =33* * =66,35 ml · Geelimaatriksi maht Vg = k · Vt=0,1*66,35=6,635 ml maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg= 66,35-6,635=59,715 ml
Korduvektraktsiooni ma ei teinud, kuna esimese oktaanikoguse lisamisel oli sademe kohal olev ekstrakt juba värvitu. Minul tuli ekstrakti mõõtesilindrisse 16,4 ml (ekstrakti kogumaht). Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Karotenoidide neeldumisspekter mõõtsin vahemikus 350-650 nm ning võrdluslahusena kasutasin puhast ektrahenti, milleks oli minu katse puhul oktaan. Töötasin klaasküvettidega. Pärast masina töövalmis sättimist joonistus spektrofotomeetri ekraanile uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega sain kindlaks määrata need lainepikkused, kus paiknesid iseloomulikud neeldumismaksimumid (max) ja maksimumidele vastavad absoptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. Trükkisin neeldumisspektri välja. Lainepikkus max Absorptsioon A (nm) 1 536 0,0317
Ensüümreaktsiooni käigus hüdrolüüsitakse pNPP p-nitrofenooliks ja anorgaaniliseks fosfaadiks. Protoneeritud vormis p-nitrofenool ei neela nähtavat valgust, kuid aluselises keskkonnas deprotoneeritud vormis (p-nitrofenolaat) neelab intensiivselt valgust lainepikkustel 400-415 nm (ekstinktsioonikoefitsient 410 = 18400 M-1cm-1). Kuivõrd pNPP neelab ainult spektri ultraviolettpiirkonnas (vt joonis 2), saab spektrofotomeetri abil jälgida p- nitrofenolaadi tekkimist ning määrata reaktsiooni toimumise kiiruse. Antud töös kasutatakse peatatud reaktsiooni meetodit, kus reaktsioon lõpetatakse NaOH lisamise teel. Tekkinud produkti hulga/kontsentratsiooni arvutamiseks määratakse optiline tihedus lainepikkusel 410 nm. 1)ENSÜÜMI KONTSENTRATSIOONI (E) MÕJU REAKTSIOONI KIIRUSELE (v) Selles katses varieerisime fosfataasi kontsentratsiooni, teised parameetrid (substraadi
Sel ajal panin valmis 4 puhast katseklaasi ning väikesed plastlehtrid ja paberfiltrid. Proovid, milles sade oli põhja settinud, filtrisin kuivadesse katseklaasidesse. Kuna saadud filtraadid pidid olema täiesti selged, kordasin filtrimist kahe katseklaasiga. Seejärel määrasin spektrofotomeetril nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse lainepikkusel = 280 nm, kasutades 1 cm läbimõõduga kvartsküvette. Spektrofotomeetri näidud: 1. Lahus: 0,388 2. Lahus: 0,530 3. Lahus: 0,670 4. Lahus: 0,883 Kaliibrimisgraafikult leidsin vastavalt proovide optilisele tihedusele neis sisalduva türosiini kontsentratsioon. C1 = 0,0601 mg/ml t1 = 0 s C2 = 0,0804 mg/ml t2 = 5 min = 300 s C3 = 0,1066 mg/ml t3 = 10 min = 600 s C4 = 0,1308 mg/ml t4 = 15 min = 900 s
Panin valmis 25 ml mõõtesilindri koos lehtri ja filterpaberiga. Uhmrisse lisasin väikeste koguste kaupa ekstrahenti, segasin jätkuvalt uhmrinuiaga materjali, seejärel lasin sademel settida ja dekanteerisin lahuse mõõtesilindrisse. Kordasin kuni sademe kohal olev ekstrahent muutus värvusetuks. Ekstrakti kogumaht oli 16 ml. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350-650nm, kasutades võrdluslahusena puhast lahust. Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega näidatakse ära ja märgitakse need lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad absorptsiooni täpsed väärtused. Seejärel trükitakse neeldumisspekter välja. 478 nm A 0,5590 451,5 nm A 0,6255 platoo 423-430 nm A 0,4480- 0,4722 Spektri analüüsimisel võrreldakse uuritava lahuse neeldumisspektril esinevate
· Ekstrahkeeritakse karotenoidid, kasutades lahustina petrooleetrit ( = 0,69 g/ml) · Uhmris olevale massile lisatakse ekstrahenti, segatakse ja ekstrakt viiakse metalllusikaga filtrile · Protsessi korratakse, kuni ekstrakt on värvitu · Ekstakti koguti 16 ml Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs · Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse vahemikus 350 650 600nm · Võrdluslahusena kasutatakse puhast petrooleetrit · Spektrofotomeetri ekraanile joonistub neeldumisspekter, millel märgitakse ära iseloomulikud neeldumismaksimumid ja nendele vastavad optilise tiheduse väärtused · Neeldumismaksimumid: o 445,5 nm, 0,2659 A o 470,0 nm, 0,3481 A o 500,5 nm, 0,2671 A · Neeldumisspekter trükitakse välja · Iseloomulikke neeldumismaksimume võrreldakse teatmeteostes leiduvate andmetega · Kirjanduse põhjal on tegemist lükopeeniga (tegelikud neeldumismaksimumid
et eluendi nivoo oleks kolonni peas koguaeg sama, sest see tagab uuritav lahuse ühtlasema kiirusega läbivuse kolonnist. 9. Lõpetasin elueerimise, kui eluaadi summaarne maht oli sama, mis arvutuslik kogumaht. Proovide analüüsimine Selleks, et teada saada aine kontsentratsiooni mõõtu, mõõtsin kõikide proovide (va täiesti värvusetute) optilise tiheduse ehk absorbtsiooni. Optilist tihedust määratakse aine neeldumis- maksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetri abil. Ainete lainepikkused: · Sinine (Dekstraansinine) 670nm · Pruun (Müoglobiin) 410nm · Kollane (DNP- aspartaat) 360 nm Fraktsiooni Elueerumismah Absorbtsioo nr t n (V, ml) (A) Eeljooks 33 0 Dekstraansini ne, 670nm 1 35 0,0389 2 37 0,2726 3 39 0,1953
Materjali segasin jätkuvalt uhmri nuiaga, sademel lasin põhja settida ja selle kohal olev ekstrakt kantsin teelusika abil filtrile ning alustasin ekstrakti kogumist mõõtsilindrisse. Seda operatsiooni kordasin kuni sademe kohal olev ekstrakt muutus värvusetuks. Lõpuks määrasin ekstrakti kogumahu. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Neeldumisspekterit mõõtsin nähtava valguse lainepikkustel 350-650 nm. Nullisin heptaaniga ning mõõtsin oma ekstrakti neeldumisspektrit. Spektrofotomeetri ekraanile tuli neeldumisspekter, kursori nihutamisega leidsin ekstrakti neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad optilise tiheduse täpsed väärtused. Tulemused: Ekstrakti kogumaht: 15 ml Heptaani tihedus 0,684g/cm3 Kolm neeldumismaksimumi: 1. =503,5 nm 0,3710 A E1%=3150 2. =473,0 nm 0,4749 A E1%=3450 3. =447,0 nm 0,3497 A E1%=2250 Tomatis ei ole karotenoidide segu, ainus karotenoid on lükopeen, mille
Kolorimeetrilised meetodid on laialdaselt kasutatavad vahendid keskkonnaanalüüsidel. Peaaegu kõik anioonid, kõik metallid, ja paljud ainete füüsikalis-keemilised omadused võivad olla määratud kolorimeetriliste meetodite abil. Väga saastatud proovide korral ei ole aga see määramisviis usaldusväärne. Lihtne ja odav meetod, ühenditel on teada kindel lainepikkus spetsiifiline värvireaktsioon. UV-Vis spektrofotomeetri tööpõhimõte. Mis komponentidest koosneb seade? Mis on selle seadme kasutusala keskkonnaanalüüsides? Valgusallikas-kollimaator (lääts) monokromaator (prisma) sisenemispilu lahus küvetis valguse detektor digitaalne ekraan. Valgusallikas peab kiirgama valgust, mille spekter vastab määratava aine neeldumisspektrile. Ultraviolettkiirguse jaoks kasutatakse tavaliselt deuteeriumi lampe ning nähtava spektri korral volfram- hõõglampe.
kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu. Ühendatud fraktsiooni mahuks oli: 26 mL Fraktsioonide analüüsimine Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Iga segus sisalduva aine optilise tiheduse väärtust mõõtsin ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel max. Spektrofotomeetri reguleerisin järgmisele aine üleminekul vastavale lainepikkusele. Mõõtsin lainepikkustel 670 nm, 410 nm ja 360 nm (vastavalt sinine dekstraansinine, pruun müoglobiin ja kollane DNP-aspartaat). Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetril. Andmetest koostasin tabeli, mille alusel joonestasin kromatogrammi Excelis. Optiline tihedus, A Elueerimismaht V,
massile väikeste koguste kaupa ekstrahenti. Teelusika abil kantakse sademe kohal olev ekstrakt filtrile. Seda tegevust korratakse, kuni sademe kohal olev ekstrakt muutub värvusetuks. Määratakse ekstrakti kogumaht, milleks tuli 10,5 ml. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350-650 nm, kasutades võrdluslahusena puhast lahustit ehk ekstrahenti. Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega näidatakse ära ja märgitakse need lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid ja vastavad absorptsiooni täpsed väärtused: Optiline Lainepikkus tihedus A 1. 445,5 nm 0,478 A 2. 471,5 nm 0,669 A 3. 502 nm 0,561 A Neeldumisspektrid:
Ühekiirelistel spektrofotomeetritel paigutatakse valgusallikast lähtuva kiire teele vaheldumisi kontroll- ehk võrdlusproov ja uuritav(ad) proov(id). Kahekiirelistel riistadel on ühest valgusallikast lähtuv kiir jaotatud kaheks, mis võimaldab mõõta proovi optilist tihedust otseselt kontroll- ehk võrdlusproovi suhtes. Kahekiirelised seadmed on sobivamad ainete neeldumisspektrite võtmiseks. Siintoodud joonisel on esitatud ühekiirelise spektrofotomeetri optilise süsteemi skeem. 42 Tüüpilise spektrofotomeetri välimus Ühekiirelise spektrofotomeetri optiline süsteem NB! Enne tööleasumist tuleb alati tutvuda konkreetse spektrofotomeetri tööpõhimõttega ja omandada seadme kasutamiseks vajalik vilumus. Aine kontsentratsiooni spektrofotomeetrilise määramise üldphimtted
destillatsiooniaparaati. Seal lisati proovile 10% NaOH lahust kuni proov värvus roheliseks. Lendub NH2 püüti kinni 2% boorhappe lahusega. Üle destilleerunud N kogus tehti kindlaks 0,01 M HCl-ga tiitrimise tee. Selleks kulunud koguse alusel leiti N-sisaldus väetises Fosforisisalduse määramine- määrati kolorimeetriliselt. 5ml lahusele lisati reaktiivide segu . tekkind kollase värvuse intens mõõdeti spektrofotomeetri abil. Lahuse opt tiheduse alusel leiti kalibreerimiskõvera abil uuritava lahuse fosforisisaldus mg/100ml kohta ning selle kaudu väetise fosforisisaldus Väetistarve- taimedele omastavate toiteelementide sisaldus Keemilise analüüsi meetodid- põhinevad mullas olevate taimedele kättesaadavate toiteelementide sisalduse määramisel laboratoorsel teel. Nende oluliseks lüliks mullaproovide võtmine. Proov võetakse max 5ha suuruselt alalt mullapuuriga. Keskm
hakkasin neeldumisspektri võtma. 2. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Neeldumisspektri määramiseks sobivad sellised spektrofotomeetrid, mis võimaldavad valitud spektriosas lainepikkust sujuvalt muuta. Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350650 nm, kasutades võrdluslahusena puhast heptaani. Kuna neeldumisspekter mõõdetakse nähtava valguse lainepikkustel, siis on vaja töötada kvartsküvettidega. Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega naitasin ära ja märgitasin protokollivihikusse need lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid (max) ja maksimumidele vastavad absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. Seejärel trükkisin neeldumisspekter välja ja jätkasin spektri analüüsimist. Töötulemus Spektri analüüsimisel märkasin neeldumismaksimumi asukohti (lainepikkusi). Sain 2 neeldumismaksimumi
optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest. Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetritel. Ning alustasin mõõtmisest lainepikkusega 670nm. Esiteks mõõtsin kolbide optilist tihedust sinise värvusega, ehk dekstraansinisega. Ning kui adsorbtsiooni näitaja jäi võrdseks nulliga, siis reguleerisin spektrofotomeetri nii, et lainepikkus saaks võrdseks 410nm-ga. Kui adsorbtsiooni näitaja jälle sai võrdseks nulliga, reguleerisin lainepikkust nii, et oleks 360nm. Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. Fraktsiooi nr Elueerimismaht Optiline tihedus Ühendatud fraktsioon 23 cm3 0
· Materjali segasin uhmri nuiaga, sademel lastakse põhja settida ja selle kohal olev ekstrakt kantsin teelusika abil filtrile. Seda operatriooni korratasin kuni sademe kohal olev ekstrakt muutub värvusetuks. · Lõpuks määrasin kindlaks ekstrakti kogumaht. (V=9 ml) Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs: · Spekter mõõtsin lainepikkuste vahemikus 350-650 nm,kasutades võrdluslahusena puhast lahustit (Petrooleeter). · Spektrofotomeetri ekraanile joonistus uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega näitasin ära need lainepikkused, kus paiknesis iseloomulikud neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. Lainepikkus Optiline tihedus 421,5 nm 0,0852 A
Lõpuks määratakse kindlaks ekstrakti kogumaht. Töö toimub tõmbe all! Kasutasin pulbrilist paprikat (maitseaine). Ekstrahendiks oli oktaan. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Enne tööle asumist tuleb tutvuta spektromeetri kasutusjuhistega. Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350650 nm. Spektromeeter nullitakse kasutatud ekstrahendiga. Töötada võib klaasküvettidega, sest mõõtmine toimub nähtava valguse lainepikkusel. Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter. Sealt loetakse lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid (max) ja maksimumidele vastavad absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. Järgneb spektri analüüs. Spektri analüüsimisel võrreldakse uuritava lahuse neeldumisspektril esinevate neeldumismaksimumide asukohti (lainepikkusi) teatmeteostes leiduvate andmetega, järeldatakse kas tegemist on puhta -karoteeniga või karotenoidide seguga.
UV-Vis spektroskoopia uurib neeldumisspektreid lähi-ultraviolettkiirguse ja nähtava valguse piirkonnas kolorimeetria võimaldab värviliste ühendite kontsentratsiooni määramist sõltuvalt nähtava valguse neeldumisest infrapunaspektroskoopia (IP või IR) uurib neeldumisspektreid lähi-infrapunases piirkonnas; Fourier' spektroskoopia (FTIR). Spektrofotomeeter on seade, mis on ettenähtud vajalikus spektri osas valguse neeldumise mõõtmiseks ainetest läbiminekul. Spektrofotomeetri põhiosadeks on valgusallikas, monokromaator, uurimis- ja võrdlusobjektide kamber või hoidja, valguse andur ja registreeriv seade. Sõltuvalt fotomeetri täiuslikkuse tasemest võib lisanduda veel rida plokke hõlbustamaks fotomeetriga töötamist ja mõõtmistulemuste registreerimist ning töötlemist, kuni arvutiga juhitavate täisautomaatsete kompleksideni välja. Uuritavat või võrdlusobjekti läbinud valguse kiirgusvoogu võib mõõta erinevate andurite ja registreerivate seadmete abil
UV-Vis spektroskoopia uurib neeldumisspektreid lähi-ultraviolettkiirguse ja nähtava valguse piirkonnas kolorimeetria võimaldab värviliste ühendite kontsentratsiooni määramist sõltuvalt nähtava valguse neeldumisest infrapunaspektroskoopia (IP või IR) uurib neeldumisspektreid lähi-infrapunases piirkonnas; Fourier' spektroskoopia (FTIR). Spektrofotomeeter on seade, mis on ettenähtud vajalikus spektri osas valguse neeldumise mõõtmiseks ainetest läbiminekul. Spektrofotomeetri põhiosadeks on valgusallikas, monokromaator, uurimis- ja võrdlusobjektide kamber või hoidja, valguse andur ja registreeriv seade. Sõltuvalt fotomeetri täiuslikkuse tasemest võib lisanduda veel rida plokke hõlbustamaks fotomeetriga töötamist ja mõõtmistulemuste registreerimist ning töötlemist, kuni arvutiga juhitavate täisautomaatsete kompleksideni välja. Uuritavat või võrdlusobjekti läbinud valguse kiirgusvoogu võib mõõta erinevate andurite ja registreerivate seadmete abil
optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest. Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetritel. Ning alustasin mõõtmisest lainepikkusega 670nm. Esiteks mõõtsin kolbide optilist tihedust sinise värvusega, ehk dekstraansinisega. Ning kui adsorbtsiooni näitaja jäi võrdseks nulliga, siis reguleerisin spektrofotomeetri nii, et lainepikkus saaks võrdseks 410nm-ga. Kui adsorbtsiooni näitaja jälle sai võrdseks nulliga, reguleerisin lainepikkust nii, et oleks 360nm. Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. Fraktsiooi nr Elueerimismaht Optiline tihedus Ühendatud fraktsioon 23 cm3 0
Lasen sademel põhja settida ning selle kohal oleva ekstrakti kannan teelusika abil filtrile, sadet kaasa ei võta. 11. Kordan eksraktsiooni, kuni sademe kohal olev ekstrakt muutub värvusetuks. 12. Viin kõik ekstraktid kogun loomulikult mõõtsilindrisse 13. Määran kindlaks ekstrakti kogumahu: 25 ml NEELDUMISSPEKTRI VÕTMINE JA SPEKTRI ANALÜÜS: 14. Täidan ühe klaasküveti heptaaniga. 15. Valin ekraanilt spektrofotomeetria 16. Nullin mõõdud (base correction) 17. Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega näitan ära ja märgin protokollivihikusse need lainepikkused, kus, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid (max) ja maksimumidele vastavad absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. Saadud piikide tipud: Piigi tipp Lainepikkus (nm) Optiline tihedus 1
Fotoelektronkordisti- PMT koosneb fototundlikkust katoodist, dünoodidest ja anoodist. Dünoodidele on rakendatud pinge, mis kiirendab elektrone ja iga elektron, põrkudes dünoodi pinnaga vabastab mitu elektroni. Vool kasvab laviinina. PMT on mõeldud nõrga kiirguse mõõtmiseks. On võimalik detekteerida üksikuid footoneid. PMT tundlikkusele paneb piiri haavelmüra ja pimevool. Spektrofotomeetri ja fotomeetri erinevus- Spektrofotomeeter: Fotomeeter: Skaala laiendamine- 1)tavalises absorptsioon-fotomeetrias: T=0%- kiir blokeeritud, T=100%- solvendi neeldumine 2)“kõrge absorptsioon“- T=0%- kiir blokeeritud, T=100% Cref lahus, Cref < Cproov. 3)“jälgede analüüs“: T=0%- Cref > Cproov, T=100%- solvent. 4)“maksimaalse täpsuse meetod“- T=0% C ref >Cproov, T=100% Cref < Cproov UV-vis spektroskoopia 22
· Lõpuks määratakse kindlaks ekstrakti kogumaht ning võetakse neeldumisspekter. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs · Neeldumisspekter määratakse spektrofotomeetriga, mis võimaldab valitud spektriosas lainepikkust muuta. · Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse vahemikus 350 650 nm ja võrdlusena kasutatakse puhast petrooleetrit. · Töötatakse klaasküvettidega, sest mõdetakse nähtava valguse osas. · Spektrofotomeetri ekraanile moodustub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel näidatakse ära neel lainepikkused, kus paiknevad neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad absorptsiooni täpsed väärtused. · Spektrit analüüsitakse võrreldes uuritava lahuse neeldumisspektril esinevate neeldumismaksimumide asukohti teatmeteostes leiduvate andmetega erinevate karotenoidide neeldumismaksimumide paiknemise kohta.
Absorbtsioonfotomeetrid: filterfotomeetrid (piiratud lainepikkuste arv, odavad, suure valgusjôuga) spektrofotomeetrid (sobiv lainepikkuste valik monokromaatoriga, kallid, väike valgusjôud) Ühekiire spektrofotomeeteri kasutamise prodseduur: môôdetakse eraldi proovi ja kontroll-lahust (reference). 100% neeldumine seatakse blokeeritud kiiega, 0% neeldumine - solvendi järgi. ehitatakse standardite järgi kalibreesimissirge ja proov moodetakse samadel tingimustel. Ühekiire spektrofotomeetri näide (Spectronic 1001). kasutab kahte detektorit ja kahte valgusallikat. Kahe kiirega instrumendid: Monokromaatne kiir jagatakse kahte ossa, üks läbib proovi, teine kontroll-lahust Kontrollkiir kompenseerib valgusallika vôimsuse vôi detektori tundlikkuse sôltuvust lainepikkusest (elektroonselt, väljundpilu laiuse muutmisega vôi optilise kiiluga) Valgusallika müra (intensiivsuse kôikumine) kompenseerub, kuna proovi ja kontrolllahust môjutatakse ühtemoodi.
lahustumatu. 6) Sulamistemperatuur (mis see on, milleks seda määratakse) Aine sulamistemperatuur on temperatuur, mille juures aine tahke ja vedel faas on normaalrõhul tasakaalus. Sulamistemperatuurist madalamatel temperatuuridel on aine tahkes olekus, sellest kõrgematel temperatuuridel aga vedelas olekus. Sulamistemperatuur iseloomustab hästi ainet ja tema puhtusastet. 7) Spektrofotomeetria (põhimõte, milleks kasulik/vajalik) Spektrofotomeetri abil on võimalik uurida, kuidas neelab uuritav aine elektromagnetkiirgust erinevatel lainepikkustel (aine neeldumisspekter; vt joonis 4). Neeldumisspekter võimaldab aineid identifitseerida ja hinnata nende puhtusastet (erinevatel ainetel on erinev neeldumisspekter). Lisaks ainete identifitseerimisele võimaldab neeldumisspekter määrata ka ainete kontsentratsioone. Seose aine kontsentratsiooni ja absorptsiooni (kindlal lainepikkusel) vahel annab Lambert-Beeri seadus: A = c · · b
4. Selgitage spektrofotorimeetri tööpõhimõtet. Spektrofotomeetrite oluliseks karakteristikuks on mõõtmiseks kasutatava kiirguse lainepikkuste intervall (riba laius) ja absorbtsiooni mõõtmise lineaarne piirkond (ulatus). 18 Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350650 nm, kasutades võrdluslahusena puhast lahustit (ekstrahenti). Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega näidatakse ära ja märgitakse protokollivihikusse need lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid (max) ja maksimumidele vastavad absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. 5. Millises lainepikkuste vahemikus paiknevad karotenoidide neeldumismaksimumid ja millest on see tingitud? Karotenoidide võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas (~400..
Analüüsimeetodina on antud magistritöös kasutatud aatomabsorptsioon- spektraalanalüüsi (AAS). AAS-I meetod põhineb vabade aatomite võimel absorbeerida kiirgusenergiat. Määratakse kiirgusallikast lähtuva valguse intensiivsuse vähenemine proovi sisaldava mõõteraku läbimisel, mõõterakuks on tavaliselt gaasipõleti leek või grafiitahjust saadav kuumade gaaside pilv. Joonisel 4 on toodud ühekiirelise leegi põhimõttel töötava AA-spektrofotomeetri põhimõtteline skeem. Küttegaasideks on tavaliselt õhk ja atsetüleen (propaan). Kiirgusallikaks (2) on õõneskatoodlamp, mis kujutab endast silindrikujulist kvartsist eesaknaga klaasanumat. AAS on vaba spektraalsetest segajatest, kuna õõneskatoodlambist lähtuvat valgust võivad absorbeerida ainult lambi katoodi materjaliks oleva elemendi aatomid. Meetod ei ole vaba keemilistest segajatest , mis esinevad leegiga AAS meetodil ning mis
annaabi.ee 
