Ensümoloogia protokoll (1)

ALUSELISE FOSFATAASI ENSÜÜMIKINEETIKA
PROTOKOLL
Koostanud :
LUISE TIKS
YASB61
112332
SISSEJUHATUS
Aluseliseline fosfataas on laia substraatspetsiifilisusega fosfomonoesteraas, mille poolt katalüüsitavaid reaktsioone võib üldistatult esitada järgimise võrrandiga:
R – O – PO3 2- + H2O = R- OH + HPO4 2-
R tähistab mitmeid erinevaid ühendeid, nagu mono -, oligo - ja polüsaahariidid,
mono-, oligo ja polünukleotiidid jt. Aluselised fosfataasid on looduses laialt levinud, kuid tavaliselt isoleeritakse seda ensüümi E.colist või veise soolestikust. Antud töös uuritakse veise soolestiku fosfataasi ensüümikineetikat.
ALUSELISE FOSFATAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Aluselise fosfataasi aktiivsuse määramiseks kasutatakse kromogeenset substraati p-nitrofenüülfosfaati (pNPP), mille hüdrolüüsi on võimalik kvantitatiivselt jälgida. Ensüümreaktsiooni käigus hüdrolüüsitakse pNPP p-nitrofenooliks ja anorgaaniliseks fosfaadiks. Protoneeritud vormis p-nitrofenool ei neela nähtavat valgust, kuid aluselises keskkonnas deprotoneeritud vormis (p-nitrofenolaat) neelab intensiivselt valgust lainepikkustel 400-415 nm (ekstinktsioonikoefitsient 410 = 18400 M-1cm-1). Kuivõrd pNPP neelab ainult spektri ultraviolettpiirkonnas (vt joonis 2), saab spektrofotomeetri abil jälgida p-nitrofenolaadi tekkimist ning määrata reaktsiooni toimumise kiiruse.
Antud töös kasutatakse peatatud reaktsiooni meetodit, kus reaktsioon lõpetatakse NaOH lisamise teel. Tekkinud produkti hulga/kontsentratsiooni arvutamiseks määratakse optiline tihedus lainepikkusel 410 nm.
1)ENSÜÜMI KONTSENTRATSIOONI (E) MÕJU REAKTSIOONI
KIIRUSELE (v)
Selles katses varieerisime fosfataasi kontsentratsiooni, teised parameetrid (substraadi kontsentratsioon, pH ja temperatuur) hoidsime konstantsetena.
1) Segasime kokku puhverlahuse, H2O ja pNPP ning inkubeerisime 2-3 minutit toatemperatuuril
2) Lisasime segule ensüümi ja inkubeerisime toatemperatuuril 15 minutit
3) Peatasime reaktsiooni 600 l 0.1 M NaOH lisamisega
4) Määrasime optilise tiheduse 405 nm juures, arvutasin selle järgi produkti kontsentratsiooni ja reaktsiooni kiiruse (v).
Selleks kasutasin korrigeeritud optilisi tihedusi (lahutasin optilisest tihedusest ilma ensüümita lahuse optilise tiheduse 0,05). Kasutasin valemit A=ε*C*l, kust avaldasin C=A/(ε*l). ε= 18400M-1cm-1, A on korrigeeritud optiline tihedus ja l=0,5 cm.
Arvestades, et valgu kontsentratsioonile 1 mg/ml vastab lainepikkusel 280nm optiline tihedus 1 ja ensüümi alglahuse 89 kordse lahjenduse optiline tihedus lainepikkusel 280 nm on 0.059, arvutasin ensüümi eriaktiivsuse .
Selleks arvutasin valgu ekstinktsioonikoefitsiendi: ε=A/(C*l)
ε=1/(1mg/ml*0,5cm) =2ml/(mg*cm)
Saadud ekstinktsioonikoefitsienti kasutasin valgu alglahuse kontsentratsiooni arvutamiseks:
C=89*A/(ε*l)
C=89*0,059/(2*0,5)=5,25 mg/ml
Arvestades, et me tegime kasutasime 120000 kordset lahjendust, oli kasutatud valgulahuse kontsentratsioon 0,00004375 mg/ml.
Tulemused:
Katse nr
Puhverlahus
H2O
pNPP
NaOH
Ensüüm, lahj 120000
Lahuse ruumala
Ensüümi konts. μg/ml
Optiline tihedus
Produkti konts, μM
V, μM/min
1
250
210
40
600
0
1100
0,00000
0,05
0,000
0,00
2
250
200
40
600
10
1100
0,00040
0,15
10,870
0,72
3
250
190
40
600
20
1100
0,00080
0,21
17,391
1,16
4
250
180
40
600
30
1100
0,00119
0,32
29,348
1,96
5
250
170
40
600
40
1100
0,00159
0,39
36,957
2,46
6
250
160
40
600
50
1100
0,00199
0,43
41,304
2,75
7
250
150
40
600
60
1100
0,00239
0,49
47,826
3,19
Koostasin graafiku teljestikus v / E
Leidsin valgu koguse igas proovis valemiga m=C*V, ning leidsin valgu aktiivsuse ja eriaktiivsuse jagades ensüümi aktiivsuse ensüümi kogusega.
Katse nr
Ensüüm, lahj 120000
Ensüümi kogus, μg
V, μM/min
Ensüümi aktiivsus, U
Eriaktiivsus , U/mg
1
0
0
0,00
2
10
0,000438
0,72
0,00080
1828,57143
3
20
0,000875
1,16
0,00128
1462,85714
4
30
0,001313
1,96
0,00215
1638,09524
5
40
0,00175
2,46
0,00271
1548,57143
6
50
0,002188
2,75
0,00303
1385,14286
7
60
0,002625
3,19
0,00351
1337,14286
Keskmine:
0,00225
1533,39683
2) SUBSTRAADI KONTSENTRATSIOONI (S) MÕJU ENSÜÜMREAKTSIOONI KIIRUSELE
Varieerisime substraadi kontsentratsiooni, ensüümi kontsentratsiooni hoidsime konstantsena.
1) Segasime kokku puhverlahuse, H2O ja pNPP ning inkubeerisime 2-3 minutit toatemperatuuril
2) Lisasime segule ensüümi ja inkubeerisime toatemperatuuril 15 minutit
3) Peatasime reaktsiooni 600 l 0.1 M NaOH lisamisega
4) Määrasime optilise tiheduse 405 nm juures, arvutasin selle järgi produkti kontsentratsiooni ja reaktsiooni kiiruse (v) analoogselt eelmise punktiga .
Tulemused:
Katse nr
Puhverlahus
H2O
pNPP
NaOH
Ensüüm, lahj 120000
Lahuse ruumala
Ensüümi kogus, μg
Ensüümi konts. μg/ml
Optiline tihedus
Produkti konts, μM
V, μM/min
1
250
245
0
600
10
1105
0,000438
0,00040
0,05
0,000
0,00
2
250
243
2
600
10
1105
0,000438
0,00040
0,06
1,087
0,07
3
250
241
4
600
10
1105
0,000438
0,00040
0,08
3,261
0,22
4
250
235
10
600
10
1105
0,000438
0,00040
0,1
5,435
0,36
5
250
225
20
600
10
1105
0,000438
0,00040
0,11
6,522
0,43
6
250
205
40
600
10
1105
0,000438
0,00040
0,1
5,435
0,36
7
250
125
120
600
10
1105
0,000438
0,00040
0,12
7,609
0,51
8
250
85
160
600
10
1105
0,000438
0,00040
0,12
7,609
0,51
9
250
45
200
600
10
1105
0,000438
0,00040
0,12
7,609
0,51
Arvutasin Km ja Vmax väärtused ja nende standardhälbed mittelineaarse korrelatsiooni abil
Km= 27,95 +- 7,34 μM
Vmax= 0,518 +- 0,028 μM/min
Katse nr
Substraadi konts, μM
V, μM/min
Arvutatud V, μM/min
Hälve
1
0,00
0,00
0,00
0,00
2
9,05
0,07
0,13
-0,06
3
18,10
0,22
0,20
0,02
4
45,25
0,36
0,32
0,04
5
90,50
0,43
0,40
0,03
6
181,00
0,36
0,45
-0,09
7
542,99
0,51
0,49
0,02
8
723,98
0,51
0,50
0,01
9
904,98
0,51
0,50
0,01
Mudel tundub küllaltki adekvaatne, hälvete jaotus on küllaltki ühtlane, ühe punkti hälve on märgatavalt suurem, kui teistel, kuid see võib olla tingitud näiteks mõõtmisveast.