Biokeemia 3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE Sidrunimahl (0)

TTÜ
Bioorgaanilise keemia õppetool
Töö nr 3.3
GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
Tatjana Rudenko
KAKB61
Töö teostamise
kuupäev:
4.04.2012
Kontrollitud:
Arvestatud:
3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
Teooria
Glükoosi kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes vedelikes kasutatakse ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensäämide glükoosi oksüdaas (GOD) ja peroksüdaas (POD) kasutamisel . See meetod võimaldab määrata glükoosi ka teiste teendavate suhkrute juuresolekul.
Glükoosi oksüdaas katalüüsib glükoosi oksüdeerumist hapniku toimel glükohappeks. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.
Peroksüdaas on koostisest ka liitvalk ja selle toimel leiab aset spetsiifiliste substraatide oksüdeerumine H2O2-lt pärineva hapniku abil. Oksüdeerides, mõned substraadid anaavad värvilisi produkte. Siis saab kasutada spektrofotomeetri ning jälgida värviliste ühendite kontsentratsiooni, mis on võrdilises sõltuvuses glükoosisisaldusest.
Peroksüdaas
Oksüdeeritud substraat + H2O2 → Taandatud substraat + 2 H2O
Värvusetu Värviline
Peroksüdaasi toimel oksüdeeuva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensiini derivaate. Üheks võimaliseks on o-taoliin, misse helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 630 nm.
Oma töös ma kasutasin substraadina kaaliumheksotsüanoferraati(II) ehk kollast veresoola. POx
katalüüsib
Fe2+ Fe3+-ks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm.
2 Fe2+
+ H2O2
+ 2 H+ → 2 Fe3+ + 2 H2O
Töö käik
Tööreaktiiv
25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse:
2,5 mg glükoosi oksüdaasi;
1,5 mg peroksüdaasi;
16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0;
K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril.
Sidrunimahl
Mul oli sidrunimahl lahjendatud 1:50
1 ml mahla + 49 ml dest.vett
Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks
Kaliibrimisgraafiku koostamiseks tuleb võtta kolm teatud glükoosikontsenratsiooniga proovi ja võrrelda kontsentratsioone spektrofotomeetriga antud tulemustega ( lainepikkus 410 nm) ning koostada graafikut .
Proovide mistamine aldab standard+lahusest, mis sisaldab täpselt 1 mg/ml glükoosi. Sellest lahusest valmistatakse kolm lahjemat proovi, reeglina nande kontsentratsioonid on 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Skeem on toodud allpool.
Värvusreaktsiooni läbiviimine
Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. Selleks
asetatakse katseklaaside statiivi 6 puhast, kuiva katseklaasi ja nummerdatakse.
1 – nullproov, destilleeritud vesi (näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni)
2 – 1 ml uuritavat lahust
3 – 1 ml uuritavat lahust
4 – 1 ml glükoosilahust (0,25 mg/ml)
5 – 1 ml glükoosilahust (0,125 mg/ml)
6 – 1 ml glükoosilahust (0,062 mg/ml)
Igasse katseklaasi pipeteeritakse 3 ml tööreaktiivi ja loksutatakse kohe, et saavutada
ühtlast kontsentratsiooni.
Pärast tööreaktivi lisamiseks väärvus muutus kollakaks igas kasteklaasis.
Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine
Pärast reaktsiooni läbiviimist koostan kaliibrimisgraafiku ja selle abil leian glükoosisisaldust sidruimahlas.
Kolv
Optiline tihedus (ABS)
Opt. tihedus – 0 proov
0 proov
0,047
Sidrunimahl
0,083
0,036 KeskmineD väärtus?
Sidrunimahl
0,091
0,044
Glükoosilahus 0,25
0,203
0,156
Glükoosilahus 0,125
0,114
0,067
Glükoosilahus 0,062
0,079
0,032
Keskmine väärtus on (0,036 + 0,044)/2 = 0,04 ABS
Tulemuseks on 0,02 mg/ml. Kasutades valemit siit saab arvutada protsendilist glükoosisialdust sidrunimahlas.
X = C ⋅ L⋅ 10-3⋅ d ⋅ 100 , kus
C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg /ml),
L – mahla lahjendustegur
d – mahla tihedus (g /cm3).
X=0,02 *50 *10-3 * 100 = 0,1 %
Järeldus: minu sidrunis oleva glükoosi kontsentratsioon on väga madal, sidrunites on keskmiselt 0,6% glükoosi.
http://www.kliinikum.ee/attachments/article/521/Suhkur_ja_sinu_tervis.pdf - siin on öeldud, et sidrunis on 0,6 g glükoosi 100g kohta, st 0,6%
Aga 3,5% on üldist suhkru, vist sahharoosi http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9B%D0%B8%D0%BC%D0%BE%D0%BD