Praktikum 2.5 (1)

2.5 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Juhendaja : M.Kreen
Taimede fotosünteesivate kudede rakud sisaldavad fotosünteesi põhipigmente_ klorofülle, mis on kas kollased , punased või purpursed. Kuna viimased absorbeerivad valgust klorofüllist mõnevõrra erinevatel lainepikkustel, siis on nad täiendavateks kiirguse retseptoriteks.
Karoteeni (C40H56) α-,β-, ja γ-isemoeeridest omab suurimat tähtsust β- karoteen , punakasoranzi värviga isoprenoidne ühend, mille molekul loomorganismis poolestub, andes kaks retinooli ehk vitamiin A1 molekuli. α- ja γ-karoteenist tekib üks vitamiin A molekul.
β-karoteen on kristalliline aine sulamistemperatuuriga 183-184 oC, mis vees ei lahustu. Etanoolis lahustub karoteen piiratud ulatuses, kuid apolaarsetes orgaanilstes lahustites lahustub hästi. Kuna β-karoteeni molekul, nagu teisedki karotenoidid , sisaldab hulgaliselt konjugeeritud kaksiksidemeid, siis neelab ta intensiivselt valgust spektri nähtavas osas. Seetõttu saab karoteeni sisaldust uuritavas materjalis objektiivselt iseloomustada neeldmisspektri järgi. Puhtal karoteenil on apolaarsetes lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri sinises piirkonnas 450 ja 480 nm juures. Kui proov sisaldab üheaegselt erinevaid karotenoide, võib neeldumisspekter oluliselt muutuda ja sisaldada nimetatuist erinevaid neeldumismaksimume. Kui proovis sisaldub samal ajal ka klorofüll, siis on täheldatavad neeldumismaksimumid lainepikkustel 425 ja 650 nm.
Antud töö eesmärgiks on apelsini koorest eraldatud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektofotomeetril ja selle alusel uurivata materjali karotenoidse koostise iseloomustamine ja β-karoteeni sisalduse määramine uuritavas proovis.
Töö käik:
Karotenoide isoleermine taimsest materjalist
Eelpeenestatud apelsini koorest võtsin tehnilistel kaaludel 1,04 g Lõplikuks peenestamiseks hõõrusin väljakaalutud proovi uhmris vähese pestud liivalisandiga ühtlase massi saavutamiseni. Siis lisasin sinnasamasse üksikute portsjonitega kaupa veevaba Na2SO4, et vett sisuda. Jätkasin massi hõõrumist. Järgnevalt ekstraheerisin karotenoidid petrooleetriga ning filtrisin ekstrakti . Karotenoidide kvantitatiivseks määramiseks tuli ekstraktsiooni värske ekstrahendi portsjonitega korrata kuni värvitu ekstrakti saamiseni.
Neeldumisspektrite võtmine ja analüüs
Spekter mõõdetakse vahemikus 350-600 nm, kasutades võrdluslahustina puhast lahustit. Spektrofotomeetri isekirjutilt sain uuritava lahuse neeldumisspektri.
Neeldimismaksimumid paiknesid järgnevatel lainepikkustel:
465,5 nm/ 1,247 A
436,5 nm/1,379 A
415,0 nm/0,994 A
Puhta β-karoteeni vastavad lainepikkused on: 482 nm; 451 nm; 425 nm. Puhta α-karoteeni vastavad lainepikkused on 475 nm; 445 nm; 420 nm.
Minu uuritava proovi neeldumismaksimumide lainepikkused on lähemal pigem α-karoteeni vastavatele väärtustele, siis arvutan α-karoteeni sisalduse proovis. Kuna 436,5 nm kohta ei leidnud E1cm 1% väärtust, siis teen arvutuse 445 nm kohta.
α-karoteeni sisaldus uuritavas proovis:
K=(D*V*d*103)/( E1cm 1% *g),
Kus D- ekstrakti optiline tihedus,
E1cm 1% 1% α-karoteeni lahuse ekstinktioon lainepikkusel 450nm,
V-ekstrakti kogumaht ,
d-ekstrakti tihedus g/cm3 ,
g-uuritava proovi mass,
103-tegur üleminekuks milligrammidele
K=(445 nm*8ml*0,69g/cm3*103)/(2735*1,04g)=863,6 mg%