Glükoosi sisalduse määramine looduslikus objektis (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
Õppeaine YKL0063
Biokeemia
PRAKTIKUM :
Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Üliõpilane: Juhendaja : 
Kood:
Esitatud:
Sooritatud :
3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
Teooria
Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides, nagu vereseerum, toiduained, taimne tooraine jm kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel .
GOx-i süstemaatiline nimetus β,D-glükoosi: O2-oksüdoreduktaas näitab, et ta katalüüsib, D glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja β,Dglükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe.
GOx kujutab endast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina.
Vaadeldava meetodi järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor: H2O2 oksüdoreduktaas.
POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo - ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide (elektronide doonorite) oksüdeerumist (= dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O.
Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine:
Peroksüdaas
Taandatud substraat + H2O2 → Oksüdeeritud substraat + 2 H2O
Värvusetu Värviline
Peroksüdaas

2 Fe2+
+ H2O2
+ 2 H+ → 2 Fe3+ + 2 H2O

Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis.
Tööreaktiiv:
Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse:

• 2,5 mg glükoosi oksüdaasi;
  
• 1,5 mg peroksüdaasi;
  
• 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0;
  
• K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril.
  

Töö käik

Uuritava lahuse ettevalmistus
Pressisin mahla viinamarjast ja tegin 200 kordne lahjendus. Selleks võtsin 0,5 ml mahla ja 100 ml vett. Filtreerisin lahust ja kasutasin edasi filtraadi.

Glükoosilahuse valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks
Võetakse kolm 15 ml tuubi ja kasutatakse skeemi:

Võetakse 1 ml standardlahust (konts. 1 mg/ml) viiakse 15 ml tuubi ja lisatakse 3 ml dest.vett, saadakse lahus nr 1 kontsentratsiooniga 0.25 mg/ml

Võetakse 2 ml lahust 1 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 2 kontsentratsiooniga 0.125 mg/ml.

Võetakse 2 ml lahust 2 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 3 kontsentratsiooniga 0.062 mg/ml.

Reaktsiooni läbiviimine
Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi toatemperatuuril spektrofotomeetri küvettides. Selleks võtsin kuus kuiva küvetti ja nummerdasin neid.
Küvett 1: nullproov, dest.vett 250 μl
Küvett 2: uuritavat proovi 250 μl
Küvett 3: uuritava proovi paralleel 250 μl
Küvett 4: glükoosilahust 1 (0.25 mg/ml) 250 μl
Küvett 5: glükoosilahust 2 (0.125 mg/ml) 250 μl
Küvett 6: glükoosilahust 3 (0.062 mg/ml) 250 μl
Igasse küvetti lisatakse 750 μl tööreaktiivi ning segatakse läbi. Fikseerisin reaktsiooni alguse aeg ja reaktsioonsegusid hoitakse 20 minutit toatemperatuuril.
Edasi mõõtsin lahuste optilise tihedust spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm.
Tulemused
Proov
Optiline tihedus ABS
Küvett 1: nullproov
0.0000
Küvett 2: viinamarjamahl
0.0890
Küvett 3: viinamarjamahl
0.0732
Küvett 4: glükoosilahust 1 (0.25 mg/ml)
0.0823
Küvett 5: glükoosilahust 2 (0.125 mg/ml)
0.0504
Küvett 6: glükoosilahust 3 (0.062 mg/ml)
0.0203
Arvutused
Paralleelproovide keskmine optiline tihedus:
Kaliibrimissgraafiku abil leidsin, et sellele optilisele tihedusele vastab glükoosi kontsentratsioon: C = 0,2377 mg/mL (200 korda lahjendatud lahuses)
Tundmatu proovi glükoosisisaldus on seega:
Glükoosisisalduse massiprotsentides naturaalse mahla suhtes arvutasin valemiga:
C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg /mL)
L – mahla lahjendustegur
d – mahla tihedus (g /cm3) d = 1,059 g/cm3
Järeldus
Katse tulemusena sain, et 1 gramm viinamarjamahla sisaldub 47,54 mg glükoosi, mis on 5,03 %.
Kirjanduse andmetel sisaldub 100 g-s viinamarjamahlas 7,65 g glükoosi ehk glükoosisisaldus on 7,65%, mis on natukene suurem kui katse tulemus., seega on tekkinud 0,18% viga mõõtmistel või on seisnud sidrunimahl ajapikku kaotanud osa oma glükoosist. Viga võiks tuleneda ebatäpsest lahjendamisest.
Kasutatud kirjandus
http://slideplayer.com/slide/4456712/
https://www.extension.iastate.edu/wine/files/page/files/compositionofgrapes.pdf