TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL MATEMAATIKA-LOODUSTEADUSKOND Geenitehnoloogia instutuut Praktiline töö nr. 2 SDS-PAGE Protokoll Koostaja: XXXXXX Juhendajad: Katrina Laks, Merlin Friedemann Tallinn, 2015.a Teoreetiline osa. Elektroforees on makromolekulide eraldamine elektrivälja toimel. SDS-PAGE (naatrium- dodetsüül sulfaat polüakrüülamiid geel elektroforees) on laialdaselt kasutatav valkude elektroforeetilise eraldamise meetod, kus valkude denatureerimiseks kasutatakse SDS-i. SDS (ka laurüül sulfaat) on anioonne detergent, mis seostub valgumolekulidega ja annab molekulidele negatiivse kogulaengu ning elektriväljas liiguvad nad anoodile (positiivselt laetud elektrood). Polüakrüülamiid geel piirab molekulide migreerumiskiirust, kusjuures väiksemad molekulid
Tallinna Tehnikaülikool IMMUNOLOOGIA Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB41 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,, laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri, mis on kindla suurusega valkude segu (selle järgi teeme hiljem kindlaks enda uuritud valgu suuruse, kD). Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine geel), Kontsentreeriv geel (ülemine
Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB-42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,,laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine:
Praktiline töö nr. 2: SDS-PAGE elektroforees NB! Geeli valmistamisel kasutasime akrüülamiidi, mis on tervisele kahjulik, seetõttu töötasime kummikinnastega. Elektroforeesi aparaadi kokku panemine Geelikihtide valmistamine: 1. Valmistada lahutav geel (resolving gel) (10%), mis koosneb järgmistest komponentidest: Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8% 3,3 ml 4x lahutava geeli puhver (1,5M Tris-Cl, pH 8,8) 2,5 ml 10% SDS 0,1 ml mQ 4,0 ml APS 70 µl TEMED 7 µl Segasime omavahel antud järjekorras kokku: vesi 4x lahutava geeli puhver SDS-i 10% lahus akrüülamiid/bisakrüülamiidi lahus
Tallinna Tehnikaülikool Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: Agnes Kivistik 112483YAGB42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile „-„laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH - rühma tõttu. Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine Kontsentreeriv geel geel), (Ülemine geel) , 4% 10% Vesi 4,5 ml 3 ml
Võimaldab muidu massi-laengu suhte alusel lahutuse asendada lihtsalt massi alusel lahutuvusega. Kasutusel valkude ja DNA puhul. Kapillaar isoelektriline fokuseerimine (CIEF) - kasutab pH gradienti katoodi ja anoodi vahel, amfoteersed molekulid a la valgud migreeruvad kohta, kus nende laeng on null, selles punktis liikumine lõpeb ja analüüt fokuseerub kintsasse tsooni oma isoelektrilises punktis. Kasutatakse valkude kirjeldamises. Proteiinide kahemõõtmeline elektroforees ja SDS-PAGE olemus. SDS; elektroforeesi läbiviimine sõltub pH-st, valgu aminohappelisest koostisest, st laengust. Valgud lõhutakse merkaptoetanooliga, lõhutakse SDS-ga (dodetsüülsulfaat) nii, et laeng muutub võrdeliseks molekulkaaluga (1 SDS 2 AH kohta), misläbi valk muutub vardakujuliseks, liikudes aeglasemalt geelil oma pikkuse tõttu. Kahemõõtmelisus 1. IEF - lahutamine laengu järgi 2. SDS-PAGE - proovi lahutamine suuruse järgi SDS-PAGE eesmärk on lahutada valke suuruse alusel.
7. Miks ei või 50% EtOH-ga pesta? Sest DNA hakkab siis lahustuma. 70% ei hakka veel lahustuma. 8. Miks on vaja Mg-d restriktaasi puhvris? Kahevalentne katioon, tavaliselt Mg++ on ensüümi tööks absoluutselt vajalik 9. Miks lahus 1? 2? 3? Lahus 1 sisaldab glükoosi, EDTA ja Tris-HCl. EDTA seob kahevalentseid metallioone, mis on vajalikud nt DNaasi tööks + EDTA aitab stabiliseerida DNA fosfaat selgrooga . Suspendeeritakse puhvris, sest vees võib DNA laguneda. Lahus 2 sisaldab SDS ja NaOH. Aluseline töötlus, mille käigus detergent SDS lõhub rakumembraani ja alus saab seonduda plasmiidse DNAga, mis seejärel denatureerub. Aluselises keskkonnas rakud lüüsuvad ja DNA denatureerub. Segada õrnalt. Lahus 3 sisaldab KOAc (kaaliumoksaalatsetaat). See neutraliseerib lahust ja lubab plasmiidse DNA renatureerimise ja KOAc aitab sadestada detergendi (SDS). Kuna viiruse genoom on väiksem, siis renatureerub ta kiiremini kui bakteri 4Mb suurune kromosoom
Nr 1. 1600W,3900 lööki/min,SDS Plus,Betoon kuni 32mm,Metall kuni 13mm,Puit kuni 40mm Aukude tegemiseks kõvasse pinda Nr 2.höövel puidust asjade siledamaks ja õhemaks tegemiseks Nr 3. Profi keevitus Fimer TM260 Saab kasutada nt. Armatuuri ühendamisel ja metall elementide juures nende kinnitamiseks Nr 4. Makita ketassaag 1100 W, 3500 p/min Laudade lõikamiseks Nr 5. 230mm ketaslõikur. 2200w pööratav käepidemega Samuti hea lõikamiseks, pisemad metalli lõikusmised hea teha. Nr 6. Gaasi puhur Võimsus: 10kW Maksimum kütusekulu: 0,75kg/h Õhuvool: 300m3/h Toitepinge: 220v Süütamine: mehaaniline (puudub termostaadi võimalus) Tööruumi soendamiseks hea asi Nr 7. Elektrihaamer 1100w naelte sisse lõõmiseks Nr 8. Otslihvija DWT 6 mm (AEG) Pöörete arv 27000 minutis, kaal 1,65kg. 6mm otsaga(collet), millega saab nii metalli, kui ka puitu lihvida (freesida). Nr 9. mootorsaag Stiga Puidu saagimiseks Nr. 10 Kärcher A2004...
faas, mis liigub mingis kindlas suunas. Eulaat, mis sisalad analüüsitavat ainet on eluent. Mobiilne faas võib olla gaas või vedelik. Eraldamine toimub valgu erinevaid omadusi kasutades: a) ioonvahetuskromatograagia- vastavalt valkude laengule b) hüdrofoobsuskromatograafia- vastavalt valkude hüdrofoobsusele c) geelfiltratsioon-kromatograafia-vastavalt valgumolekuli suurusele d) afiinsuskromatograafia-vastavalt valkude interaktsioonidele 3. Elektroforees, SDS-PAGE põhimõte, isoelektriline fokuseerimine, 2D elektroforees, valgu sõrmejälg Elektroforees- laetud molekulide liikumine elektriväljas, viiakse läbi pooltahkes keskkonnas – geelis e) SDS-PAGE – geelelektrofereesi meetod, kasutatakse ioonset detergenti SDS (sodium dodecylsulfate). Valgud denatureeritakse ja „laetakse“ SDS molekulidega (SDS’l on negatiivne laeng ja on võimeline katma suvalisi valgu molekule
Vedelikkromatograafias toimub eraldamine valgumolekulide erinevaid füüsikalis-keemilisi omadusi kasutades. Ioonvahetuskromatograafia eraldamine vastavalt valkude laengule. Hüdrofoobsuskromatograafia vastavalt valkude hüdrofoobsusele. Geelfiltratsioon-kromatograafia vastavalt valgumolekuli suurusele. Afiinsuskromatograafia vastavalt interaktsioonidele. 3. Elektroforees, SDS-PAGE põhimõte, isoelektriline fokuseerimine, 2D elektroforees, valgu sõrmejälg (protein fingerprinting). Elektroforees kujutab endast laetud molekulide liikumist elektriväljas. Valkude elektroforees viiakse läbi pooltahkes keskkonnas geelis. SDS-PAGE valgud denatureeritakse ja ,,laetakse" SDS molekulidega (SDS'l on negatiivne laeng ja on võimeline katma suvalisi valgu molekule. Valgu pinnale tekib tugev negatiivse laenguga kate. SDS molekule on kattes nii palju, et valgule
SEADUSANDLIK VÕIM: (Toompea loss- RK) *parlament võib olla ühekojaline(balti riigid) või kahekojaline (SB, Sks) ning seisulik (pere kaudu), regionaalne(valitud esindaja) *RK ül: võtab vastu seadusi ja otsuseid, võtab vastu riigieelarve, valib presidendi, kontrollib valitsuse tegutsemist, kuulutab sõjaseisukorra *RK töö-iga saadik annab ametivande lubades tegutseda lähtudes E põhisds-st. *RK tegevus-täiskogu istungid, komisjonide istungid, töö valijatega (täiskogu võtab vastu sds-d, otsused) *RK juhatus: esimees E.Ergma, 1. aseesimees L.Randjärv, 2.aseesimees J.Ratas *sdseelnõu teke: 1) valitsusest eelnõu 2) juhtivkomisjon 3) RK *sdseelnõu menetlemine: I lugemine (eelnõu ettekanded) II lugemine (lõpphääletus, vaidlused) III lugemine (parandused) NB!olulised sds-d vajavad 3 lugemist! (riigi eelarve sds) TÄIDESAATEV VÕIM: (Stenbocki maja-valitsus) *Riigikantselei- asutus, kus meie valitsus käib ja mille eesmärk on toetada Vabariigi Valitsust ja peaministrit
milliseid puhvreid oleks kõige mõistlikum kasutada (vt Fermentase kataloogist restriktaaside tabelist)? Kas Yello Tango puhvris oleks võimalik üheaegselt lõigata Cfr42I ja SmaI ensüümidega? Parim B, sobivad ka G ja Tango. Tango puhvris on võimalik lõigata üheaegselt nende ensüümidega, kuid kuna nad on aktiivsed erinevatel temperatuuridel, siis on efektiivsus suhtselt madal. 1.3) Kui palju tuleb võtta 1 M Tris-HCl, 5 M NaCl, 20% SDS ja 0,5 M EDTA-Na 2 lahuseid, et valmistada 1 ml 2 x PK puhvrit (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,44 M NaCl, 2% SDS, 25 mM EDTA-Na2). 400µl Tris HCl, 88µl NaCl, 100 µl SDS ja 50 µl EDTA-Na2 lahuseid 3 1.4) On vaja ligeerida 100 ng 5000 bp pikkune plasmiid ja 1000 bp pikkune insert. Mitu ng tuleb võtta
milliseid puhvreid oleks kõige mõistlikum kasutada (vt Fermentase kataloogist restriktaaside tabelist)? Kas Yello Tango puhvris oleks võimalik üheaegselt lõigata Cfr42I ja SmaI ensüümidega? Kui kasutada üheagselt kahte erinevat ensüümi oleks mõistlikum kasutada Tango (yellow), G (green), B (blue).Yellow Tango puhvris ei ole võimalik üheaegselt lõigata Cfr421 ja Sma1 ensüümidega, kuna temperatuurid on erinevad. 1.3) Kui palju tuleb võtta 1 M Tris-HCl, 5 M NaCl, 20% SDS ja 0,5 M EDTA-Na 2 lahuseid, et valmistada 1 ml 2 x PK puhvrit (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,44 M NaCl, 2% SDS, 25 mM EDTA-Na2). On vaja võtta: 400µl Tris HCl, 88µl NaCl, 100 µl SDS ja 50 µl EDTA-Na2 lahuseid. 1.4) On vaja ligeerida 100 ng 5000 bp pikkune plasmiid ja 1000 bp pikkune insert. Mitu ng tuleb võtta inserti, et see oleks ekvivalentne(ekvimolaarne) plasmiidiga (arvesse tuleb võtta nende 5-kordset pikkuste erinevust)
aminhappe C-terminaalsest otsast. Kümotrüpsiin lõikab aromaatsete kõrvalahelatega aminohapete juurest; trüpsiin positsiivset laengut kandvate aminohapete juurest. Spetsiifiline aktiivsus – ensüüm katalüüsib talle spetsiifilist reaktsiooni ja spetsiifiliste molekulidega?. Nt. eksonukleaasne aktiivsus, peptidaasne aktiivsus? Geelfiltratsioon Ioonvahetuskromatograafia Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis. Isoelektriline fokuseerimine – elektroforeesi geeli on moodustatud pH gradient; sellel geelil
Vali üks: c. Kohe ettevõtte alustamisel 1 Kui kaua säilitab kasutaja riskianalüüsi protokolli? 9 5 aastat 20. Ohutusalane juhendamine peab hõlmama Vali üks või enam: c. teavet töötamiskohal või selle lähedal olevatest suurema ohuga töövahenditest; d. töövahendi kasutamisest saadud kogemusi; Kemikaaliseadus 1 Mis on ohutuskaart? Kes koostab kemikaalile ohutuskaardi? Kemikaali ohutuskaart (SDS Safety Data Sheet) on professionaalseks (erialaseks) kasutamiseks mõeldud dokument, mis sisaldab ohtliku kemikaali kohta seaduses ettenähtud piisavat informatsiooni kemikaali ohutuks käitlemiseks, teavitab potentsiaalsest ohust (kõrvaltoimete tekkimise tõenäosusest) inimese tervisele ja keskkonnale ning peab võimaldama tarvitusele võtta vajalikud abinõud töötajate tervise, ohutuse ja keskkonna kaitsmiseks ettevõttes
Võtsin üleöö kasvanud bakterid ja fuugisin bakterid põhja Eemaldasin supernatanti Re-suspendeerisin pellet 0,2 ml-s E1 lahuses (50mM glükoos – teeb lahuse isotooniliseks, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10nM EDTA-Na2 – seob katioone, inhibeerides ensüüme(DNAaasid) ja destabiliseerib raku membraani, RnaasA 10 µl/ml – eemaldab bakteriaale RNA prepsist). Lisasin 0,2 ml E2 lahus(0,2 N NaOH, 1% SDS – detergent, lõhustab bakteriraku membraani, denatureerib valku ja laseb aluse DNAd degradeerima. Kuna plasmiidne DNA on tsirkulaarne, siis ahelad ei eralduvad), suspendeerisin. Inkubeerin laua peal 5 minutit. Lisasin peale 0,2 ml E3 lahus(5 M KOAc – peatab lüüsi, mille tagajärjel valgud ja genoomne DNA sadenevad välja. Reageerib SDS-da, tekitades ka mittelahustava sadet.
Tihti kasutatakse valgu standardiks ka immunoglobulin G-d (IgG). Mõõtepiirkond: Bradfordi meetodil on võimalik määrata valgu kontsentratsiooni vahemikus 100-1,500 µg/ml Bradfordi mikromeetodil on võimalik määrata valgu kontsentratsiooni 1-25 µg/ml. Segavad reagendid. Bradfordi meetodit ei sega enamus reagente (e.g. sahharoos, urea, glütserool, taandavad reagendid ja tioolid), kuid segavad detergendid (e.g. > 0.1% SDS and > 1% Triton series) või rakulised lipiidid, mis suurendavad CBBG lahuse absorbtsiooni 590 nm juures. CBBG seostub tugevasti kvartsküvettide seintele, mistõttu on soovitav kasutada klaas või plastikküvette. Reaktiivid Terve grupi peale: · 5x Bradfordi reagendi varulahus (0,01% (w/v) CBBG, 4,75% (v/v) etanool, 8,5 % (v/v) fosforhape) Iga väikse grupi peale: · 200 µl 1 mg/ml BSA lahus · 200 µl 5M NaOH · mQ vesi · 100 µl uuritav valgulahus proov nr
KE erimenetlused: Kapillaartsoonelektroforees (CZE): kõige populaarem KE liik. Puhvriks on vesilahus; lahutab ioone ja laetud molekule. Mittevesikeskkonnaline kapillaarelektroforees (NACE): kus puhvriks on orgaaniline solvent (MeOH, ACN) koos vedela soolaga, mis suurendab elektrijuhtivust; lahutab vees mittelahustuvaid orgaanilisi ühendeid. Mitsellaarne elektrokineetiline kromatograafia (MECC): kus puhvriks on vesilahus, millele on lisatud pindaktiivset ainet (naatriumdodetsüülsulfaati SDS), mis moodustab mitsellid; lahutab ka naturaalseid orgaanilisi ühendeid. Kapillaargeelelektroforees (CGE): kus kapillaaris on geel väikesed molekulid liiguvad kiiremini kui suuremad; lahutab nukleiinhappeid, proteiine. Kapillaarne isoelektriline fokusseerimine (CIEF): kus kapillaaris on geel, milles tekitatakse pH gradient; lahutab valke. Affiinsuskapillaarelektroforees (ACE): interaktsioonid lahutatavate ainete ja spetsiaalselt lisatud ühendite vahel; näiteks: antigeen-antikeha.
· Temperatuuritaluvus -30°C...+250°C SILIKOONMÄÄRE SPRAY · Valge, isoleeriv silikoonmääre. · Eriti head libestusomadused kõikidele materjalidele · Hea sissetungimisvõime. · Hea elektrit isoleeriv omadus (=14,7 kV/mm) Määriv Lukuõli-SPRAY · Pikaajaline määrimine lukkudele, hingedele ja liigenditele. · Eemaldab krigina ja nagina. · Kaitseb rooste eest. · Ei sisalda vaiku, happeid ega silikooni. · Eriti hea relvaõli. · Takistab löökmeisli tera/ SDS puuri kinnikiilumist. · Temperatuuritaluvus 30°C...+20 SILIKOONIPULK · Kummitihendite määrimiseks. · Aastaringseks kasutamiseks. · Hoiab kummidetailid elastsetena. · Takistab uste kinnijäätumist, kaotab nagina. · Kaitseb uksetihendeid rabedaks muutumise eest. HD-PUHASTUSSPRAY Eriti tõhus puhastusvahend ja õlieemaldi hoolduses, remondi- ja koostetöödel PUHASTUSSPRAY Üldpuhastusaine Pro-CLEAN PUHASTUSSPRAY Tööstusele, autoremonditöökodadele, mehaanikatöökodadele
Ttest – kui on vaja võrrelda kahe grupi (õigemini kahe üldkogumi keskväärusi) keskväärtusi. Samade objektide kordushinnang nt astra versus silva maja Kui oleks sõltumatud valimid, siis oleks reaalselt erinevad objektid nt erinevad kursused. https://www.youtube.com/watch?v=PSo6FsAkaTI Kõigepealt vaatame, kas üldse hinnangud erinevad? Valimi keskmised ja standardhälbed arvutame mõlema maja kohta välja ja teeme neist järeldused. Astra M1=2,76 Silva M2=2,24 SDa=1,26 SDs=1,04 Tulemuste järeldus : üliõpilased on rohkem rahul Astra maja ruumidega kui Silva. Teeme olulisuse testi, sest tekib küsimus, kas me saame üldistada. Meil on kaks üldkogumit ja võrdlen keskväärtusi, siis järeldub ,et ma teen t-testi. Kui meil on aga kaks või enam gruppi (üldkogumit) ja me võrdleme proportsioone, siis me nt teeme hii ruut testi (sagedustele ja objektide arvule on omad tingimused). Kui
Nüüd fuugimisel lihtne genoomset DNAd eraldada plasmiidsest. 1. Võtsin kasvanud epsis bakterikultuur, fuugisin bakterid põhja 2 min maksimumpööretel ning eemaldasin pipetiga sööde sademe kohal. 2. Esimesena lisasin 0,2 ml E1 lahust (Glükoos teeb lahust isotooniliseks, EDTA seob katioone samas inhibeerib paljusid ensüüme, Tris-HCl on puhverdav reagent ning Rnaas A eemaldab bakteraalse RNA prepsist) 3. Teisena lisasin 0,2 ml E2 lahust (SDS lahustab bakteriraku mambraani fosfolipiidid ja denatureerib valgud, NaOH denatureerib DNA struktuurid) 4. Lahus muutus „tatiseks“. Pärast 5 min inkubeerimist laua peal lahus muutus selgemaks. 5. Nüüd pipeteerisin peale 0,2 ml E3 lahust (KAc peatab lüüsi ning normaliseerib pH, mille tagajärjel valgud ja gDNA välja sadenevad) 6. Lahuses ilmusid valged helbed, mida tuleb fuugida 10 min maksimumpööretel. 7
Membraani küge seotakse Cb3 komplement faktor B abil, mis seejärel jaguneb faktor D-ks. Ba hulbib minema, Bb jääb seotuna C3b. See kompleks on alternatiivse raja C3 konvertaas, ja ei ole väga stabiilne, vajab properdiini, mis siis seondub selle kompleksiga. Konvertaas käitub analoogselt klassikalise raja konvertaasiga, lõigades C3 molekulid C3aks ja bks. Moodusutb C5 konvertaas ja samamoodi sarnaselt klassikalise rajaga moodustub lõpuks MAC. · letiini tee. ELISA, SDS-PAGE, WESTERN BLOT Immunoensümaatiline test mõõtis antikeha hulka lahuses. Peamised immunotestid on ELISA, SDS-PAGE elektroforees ja Western Blot. Sandwich ELISA: 1. Plastiku pind kaetakse esimese antikehaga 2. Lisatakse proov mis sisaldab uuritavat antigeeni ja lastakse antikehal antigeeniga seostuda. 3. Seostumata antigeen pestakse ära. 4
Membraani küge seotakse Cb3 komplement faktor B abil, mis seejärel jaguneb faktor D-ks. Ba hulbib minema, Bb jääb seotuna C3b. See kompleks on alternatiivse raja C3 konvertaas, ja ei ole väga stabiilne, vajab properdiini, mis siis seondub selle kompleksiga. Konvertaas käitub analoogselt klassikalise raja konvertaasiga, lõigades C3 molekulid C3aks ja bks. Moodusutb C5 konvertaas ja samamoodi sarnaselt klassikalise rajaga moodustub lõpuks MAC. 30. Praktikumi materjalidest: ELISA, SDS-PAGE ja Western Blot. Immunoensümaatiline test kirjeldati esmakordselt 1971 aastal Engvall ja Perlmanni poolt. See mõõtis antikeha hulka lahuses. Peamised immunotestid on ELISA, SDS-PAGE elektroforees ja Western Blot. Sandwich ELISA: 1. Plastiku pind kaetakse esimese antikehaga 2. Lisatakse proov mis sisaldab uuritavat antigeeni ja lastakse antikehal antigeeniga seostuda. 3. Seostumata antigeen pestakse ära. 4. Lisatakse
Tahtes valgumolekule elktroforeetiliselt üksteisest lahutada, siis tehes foreesi, siis negatiivse summarse laenguga valgud hakkavad separeeruma, kui neutraalsed ennast ei liiguta ja positiivsed liiguvad läbi puhvri elektroodi poole ja me kaotame nad. Seepärast valkude analüüsimisel kasutatakse sellist nippi: kõik valgumolekulid, mida me tahame analüüsida segatakse kokku sellise ainega, mille ingliskeelne lühend on SDS, sellel ainel on endal negatiivne laeng ja on võimeline katma suvalisi valgu molekule. Valgu pinnale tekib tugev negatiivse laenguga kate. SDS molekule on kattes nii palju, et valgule endale iseloomulik laeng tähtsust enam ei oma. Elektroforeesil hakkab kogu kupatus liikuma positiivse elektroodi poole. Kuidas me valgumolekule ikkagi näeme skeemil? Me võime in vitro nukleiinhappeid sünteesida radioaktiivsetena ja siis saame neid geelis visualiseeirda
* Kasuta alati kindaid. Suhtu sellisel juhul kinnastesse kui saastunutesse. * Kaalu tõmbe all. * Töötades pead tähistama ala, kus sa nendega töötad, ja selle katma lauakattega. * Kui soovid seda ainet labori piires ühest kohast teise viia, pead alati kasutama õhukindlalt suletavat konteinerit. * Kokku puutunud prahti käideldakse ohtlike jäätmetena. Akrüülamiid, teised kahe komponendiga polümeerid ja naatrium dodetsüülsulfaat (SDS) * Ära kunagi puutu neid ühendeid otseselt. Pulbri kaalumisel kasuta alati kindaid, soovitavalt ka kaitseprille ning suukaitset. Kaalu alati tõmbe all. Fenool * Fenooli nahale sattumise oht on võrdlemisi suur, aga sügelusega kergesti märgatav ning veega mahapestav. Etiidiumbromiid * EtBr läheb latekskindast läbi, aga nitriilkindast mitte. * Geeli mitte kätega puutuda. * Ruumid, kus asub geelipildistamise aparatuur, tuleb lugeda EtBr-ga saastunuks. 2. Mis on zoonoosid
· Perekond Frankia fikseerib N2, moodustades taimedel juuremügaraid. Isoleerimine loodusest. · Aktinomütseetide isoleerimiseks mullast tuleb pärssida kiirestikasvavate bakterite ja seente areng. Seente pärssimiseks lisatakse söötmesse tsükloheksimiidi. · Graamnegatiivsete kiirestikasvavate bakterite elimineerimiseks soovitatakse muld läbi kuivatada. On kasutatud ka mulla töötlemist 0.05% SDS-ga, mis tapab graamnegatiivsed bakterid ja ergutab idanema aktinomütseetide spoorid. · Selektiivse C-allikana kasutatakse kas tärklist, kitiini, huumust, tselluloosi või kaseiini. Sobib ka Czapeki sööde nitraatlämmastiku ja tärklisega. Söötme pH ca 7.2. · Aktinomütseedid kasvavad aeglaselt. Petri plaate inkubeeritakse 1-2 nädalat või isegi kauem. Selts Bifidobacteriales.
* Kasuta alati kindaid. Suhtu sellisel juhul kinnastesse kui saastunutesse. * Kaalu tõmbe all. * Töötades pead tähistama ala, kus sa nendega töötad, ja selle katma lauakattega. * Kui soovid seda ainet labori piires ühest kohast teise viia, pead alati kasutama õhukindlalt suletavat konteinerit. * Kokku puutunud prahti käideldakse ohtlike jäätmetena. Akrüülamiid, teised kahe komponendiga polümeerid ja naatrium dodetsüülsulfaat (SDS) * Ära kunagi puutu neid ühendeid otseselt. Pulbri kaalumisel kasuta alati kindaid, soovitavalt ka kaitseprille ning suukaitset. Kaalu alati tõmbe all. Fenool * Fenooli nahale sattumise oht on võrdlemisi suur, aga sügelusega kergesti märgatav ning veega mahapestav. Etiidiumbromiid * EtBr läheb latekskindast läbi, aga nitriilkindast mitte. * Geeli mitte kätega puutuda. * Ruumid, kus asub geelipildistamise aparatuur, tuleb lugeda EtBr-ga saastunuks.
ja afiinsuskromatograafia) põhimõte. Ioonvahetuskromatograafia – positiivselt laetud kerakestele seostuvad negatiivselt laetud molekulid. Positiivselt laetud molekulid ei seostu ja tulevad kolonnist läbi. Geelfiltratsioonkromatograafia – väiksed molekulid takerduvad poorsetesse kerakestesse, suured läbivad kolonni vabalt. Afiinsuskromatograafia – keraksetega kovalentselt seotud molekulidele seostuvad neile spetsiifilised molekulid. SDS-polüakrüülamiidgeel elektroforeesi tööpõhimõte. Proov geelile, valgud liiguvad + poole, saab hinnata valkude suurust Valkude ülekanne SDS-polüakrüülamiidgeelilt membraanile ning nende tuvastamine antikehade abil. Geelilt kantakse membraanile, inkubeeritakse antikehadega, loputatakse, inkubeeritakse ensüümiga, loputatakse, kromogenne dekteteerimine Kahedimensionaalse geelelektroforeesi põhimõte.
liikumist ka konformatsioon – tsirkulaarsed molekulid liiguvad kas aeglasemalt või kiiremini kui sama pikad lineaarsed molekulid. Tiheduselt sarnane vedelikele kuid füüsikalised omadused sarnanevad tahketele ainetele. Geel ujub vedeliku sees. Vannis on 2 elektroodi (+ ja -) Geeli otsas on kamm mis teeb geeli (agaroosi) sisse augud. Osakesed hakkvad agaroosis erinevatel kiirustel liikuma. Milleks tuleb valkude geel-elektroforeesil kasutada naatrium-dodetsüülsulfaati (SDS)? Sest agroosgeelis saab valke eraldada vaid laengu järgi, sest geeli poorid on valkude suuruse järgi eristamiseks liiga suured. Mass-spektromeetria. Valgu segude analüüsiks, toimub vaakumis, võimeline separeerima suuri molekule. 1. proov sisestatakse massispektromeetria aparatuuri ja aurustatakse; 2. ühendid ioniseeritakse, mille tulemusena tekivad laetud osakesed (ioonid) 3. ioonid eraldatakse analüsaatoris elektromagnet- või magnetväljade abil
* Kasuta alati kindaid. Suhtu sellisel juhul kinnastesse kui saastunutesse. * Kaalu tõmbe all. * Töötades pead tähistama ala, kus sa nendega töötad, ja selle katma lauakattega. * Kui soovid seda ainet labori piires ühest kohast teise viia, pead alati kasutama õhukindlalt suletavat konteinerit. * Kokku puutunud prahti käideldakse ohtlike jäätmetena. Akrüülamiid, teised kahe komponendiga polümeerid ja naatrium dodetsüülsulfaat (SDS) * Ära kunagi puutu neid ühendeid otseselt. Pulbri kaalumisel kasuta alati kindaid, soovitavalt ka kaitseprille ning suukaitset. Kaalu alati tõmbe all. Fenool * Fenooli nahale sattumise oht on võrdlemisi suur, aga sügelusega kergesti märgatav ning veega mahapestav. Etiidiumbromiid * EtBr läheb latekskindast läbi, aga nitriilkindast mitte. * Geeli mitte kätega puutuda. * Ruumid, kus asub geelipildistamise aparatuur, tuleb lugeda EtBr-ga saastunuks. 2. Mis on zoonoosid
seega saad vähem plasmiidi. Glükoos muudab E1 lahuse isotooniliseks, EDTA seob kahevalentsed katioone (seega inhibeerib paljusid ensüüme, kes töötamiseks neid enda koostisse vajavad) ja Tris on puhverdav reagent. RNAas A eemaldab bakteraalse RNA prepsist(ehk prepareeritavast plasmiidsest DNAst) 5. Lisa 0,2ml E2 lahust ning pipeteeri mitu korda edasi-tagasi. E2-s sisalduv SDS solubiliseerib (lahustab pisikesteks puhvris ujuvateks mullikesteks e.mitsellideks) bakteriraku membraani fosfolipiidid ning denatureerib valgud. Naatriumhüdroksiid aga denatureerib DNA struktuurid. Lahus muutub"tatiseks" 6. Inkubeeri laua peal 3 minutit. Selle aja jooksul muutub lahus selgemaks. Juhul, kui inkubeerida üle 5 minuti, saad saagise hulka bakteri genoomseid
CGE is the adaptation of traditional gel electrophoresis into the capillary using polymers in solution to create a molecular sieve also known as replaceable physical gel. This allows analytes having similar chargetomass ratios to be resolved by size. This technique is 16 commonly employed in SDSGel molecular weight analysis of proteins and the sizing of applications of DNA sequencing and genotyping. Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) CIEF allows amphoteric molecules, such as proteins, to be separated by electrophoresis in a pH gradient generated between the cathode and anode. A solute will migrate to a point where its net charge is zero
Materjal/aine Kalju Lott 25. Elektrokineetilised nähtused. Esimese rühma el. kin nähtused Elektroforees Elektroforees on protsess, kus (kolloid)osakesed liiguvad välise elektrivälja mõjul. Graanulale avaldub jõud. Elektroforeesi liikmeid on mitmeid. Ühel variandil jaotatakse laengu järgi. Teistel juhtudel võib jaotada aga molekulmassi järgi (poorne geel, ühtne laeng SDS) Elektroforeesi kaudu tseeta-potentsiaali mõõtmine Laeng avaldub järgmiselt Aga Selle modifitseerimisel (asenduse tegemisel) saame ka valemi potentsiaali leidmiseks. Seega saab elektroforeesil potentsiaal määrata Elektroosmoos Elektroosomoos on protsess, kus dispersioonikeskkond liigub, dispergeeritud faas ei liigu. See võimaldab kuivatada esemeid n. palke. Teise rühma el. kin nähtused Voolamispotentsiaal
pöördvõrdeline seos. Meditsiinis kasutatakse immuunmeetodeid nakkushaiguste, autoimmuunhaiguste, atoopilise allergia diagnostikas. Väga mitmeid biomolekule määratakse antigeen-antikeha reaktsioonil põhinevate meetoditega. Samuti kasutatakse immuunmeetodeid mitmete patoloogiate kindlakstegemisel ja diagnostikas. Immunoblot-analüüs koosneb kolmest etapist. Esiteks toimub valkude elektroforees, mille tulemusena lahutatakse antigeenid, kasutatakse SDS-PAGE. Toimub ca 1h. Teiseks etapiks on blotting e lahutatud antigeenide ülekanne geelist (SDS-PAGE) nitrotselluloosfiltrile. Kolmandaks viiakse läbi antigeen- antikeha reaktsioon. Selleks blokeeritakse nitrotselluloos „neutraalsete“ valkudega (nt rasvatu piimapulber). Primaarne antikeha lisatakse süsteemi, st seerumlahjendus. Seejärel lastakse sellel seista, st inkubatsioon seerumlahjendusega. Pärast inkubatsiooniaega detekteeritakse tekkinud antigeen-antikeha kompleksid
s acc. ja abl. sõnast su sgnum, n märk, tähis, tunnus; (sõja)lipp; secundus, a, um teine; soodus, soosiv, märguanne, signaal õnnelik; rs secundae soodsad olud, õnn silentium, i n vaikimine, vaikus sed conct. aga, kuid, ent silva, ae f mets sede, sd, sessum, re istuma; viibima, similis, e (superl. simillimus, a, um) sarnane, püsima taoline sds, is f iste, tool; asupaik, elukoht; pind, simul 1. adv. üheaegselt, ühtlasi; 2. conct., ka alus; koht, ase simulatque, simulac, simul ut niipea kui semper adv. alati simulcrum, n kujutis, kuju, pilt sentor, ris m senaator, senati liige simul, v, tum, re jäljendama, matkima; sentus, s m senat; senati istung teesklema senectus, tis f vanadus, raugaiga; (asja) sn conct
1983; Zeece et al. 1986; via its intimate association with the thin fila- Astier et al. 1993; Huff-Lonergan et al. 1995; ment (Lukoyanova et al. 2002), has been Melody et al. 2004; Rowe et al. 2004a, b). hypothesized to constitute part of a compos- When titin is degraded, a major degradation ite nebulin/thin filament (Pfuhl et al. 1994; product, termed T2, is observed that migrates Robson et al. 1995) and may aid in anchoring only slightly faster under SDS-PAGE con- the thin filament to the Z-line (Wang and ditions than intact titin. This product migrates Wright 1988; Komiyama et al. 1992). at approximately 2,400 kDa (Kurzban and Degradation of nebulin postmortem could Wang 1988, 1987; Huff-Lonergan et al. weaken the thin filament linkages at the 1995). Another titin degradation product Z-line, and/or of the thin filaments in the
selfish. The road is not symbolic anymore, they're just there for the pleasure. Finally Sal losed faith in Dean as well. As a typical beatnik Dean wants to escape the aimlessness and lonelyness in his life, he is afraid of death. Middle class, petty bourgeous, was not something for them, they were disgusted by it. 03.04.13 1960's-period of change, movements, revolutions, radical movements appeared, the youth movement, the socalled sds became very influential-student democratic society, the new left became prominent, herbert marcuse-dehumanizing effects of capitalism and modern technology, freud and marx. This decade saw series of major political assasinations in America-jfk, Robert kennedy, martin luther king. Atmosphere of violence and fear, the atmosphere was not helped in any way by the vietnam war, ended 11 years later. Disgrace for
SDLC Synchronous Data Link Control (protocol) SDLT Super Digital Linear Tape SDM System Development Multitasking SDMI Secure Digital Music Initiative/Interface SDMMC Secure Digital Multi Media Card SDMS SCSI Device Management System [NCR] SDN Software Defined Network [AT&T] SDNS Secure Data Network Service SDO Service Data Objects + Software Delivery Optimization [Borland] SDR Streaming Data Request SDRAM Synchronous DRAM SD-ROM Super Density ROM SDS Sysops Distribution System SDSL (See DSL) SDSM Super Digital Sound Management SD_STB Streaming Data Strobe [IBM] SDTV Standard Definition Television SDV Segment Delay Value + Switched Digital Video [AT&T] SDX Storage Data Acceleration SDXF Structured Data Exchange Format SEA Standard Extended Attribute [OS/2] .SEA Self Extracting Archive (file name extension) [Macintosh] SEAC * Name of first computer to use transistors, built by
where we put our cranes into Tekla and pretty much draw all our logistics in the Tekla model – we have been considering that for quite some time. We have chosen not to do 106 that because… that would be really advantageous if everybody uses the same program. But as a steel erector, we have to deal with fabricators who use just AutoCAD and other people use SDS/2 and then other use Tekla, which would be our preferred method. If we could talk the world into just going to Tekla based building design and modeling then LPR would dive in with both feet and get more up to speed to be able to do all kinds of drawing and logistics within the Tekla modeling environment. We would just work in Tekla and would probably not use CAD. But the problem is that the whole world is diversified so we are having to do import/export and kind of have a single bases for how
4 rakkudes. Seetõttu nimetatakse seda põhiliseks faktoriks. Bakteris Escherichia coli on põhiliseks faktoriks 70, Bacillus'es 43. Stressitingimustes (näit. temperatuuri tõus kasvukeskkonnas, toitainete nälg, oksüdatiivne stress) lülitatakse tööle geenid, mille promootoreid tunnevad ära alternatiivsed faktorid. faktorite tähistamisel kasutati algul indeksit, mis iseloomustas vastava valgu liikuvust SDS geelis. Paljud faktorid liikusid aga anomaalselt ning sellepärast hakati indeksina kasutama arvestuslikku molekulmassi kDa-nites, mis tuletati geeni pikkusest. Näit. Bacillus subtilise 43 algne tähis oli 55. Bacilluse puhul jäädi ka selle nomenklatuuriga hätta, kuna mitmete faktorite molekulass oli ligikaudu 30 kDa. Seetõttu võeti kasutusele tähestik. Viimasel ajal on 43 asemel kasutusel tähis A. Bakteris E. coli on teada 7 erinevat sigma faktorit Alternatiivsed faktorid bakteris E
ds võrra, mis peab olema tunduval väiksem silindri gaasiga täidetud osa pikkusest. Siis on gaasi ruumala muutus nii väike, et rõhk selle käigus märkimisväärselt ei muutu ning võime rõhu lugeda konstantseks. Siis gaasi elementaarne töö selle nihke käigus on A Fds pSds . Ühtlasi arvestame, et vastavalt silindri ruumala valemile kolvi põhja pindala korrutis kolvi nihkega võrdub gaasi ruumala juurdekasvuga, dV Sds , millest järeldub gaasi paisumisel tema poolt tehtud elementaarne töö 11 A pdV . (9.15) Siin tuleb veel tähelepanu juhtida asjaolule, et gaasi poolt sooritatud elementaarne töö pole täisdiferentsiaal, seetõttu ei saa tema ette kirjutada diferentsiaali tähist d. Täisdiferentsiaali
annaabi.ee 
