Valgu kontsentratsiooni määramine Bradfordi meetodil (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Protokoll
Valgu kontsentratsiooni määramine Bradfordi meetodil
Tallinn 2012
Spektrofotomeetria põhialused.
Valguse neeldumine keskkonnas on kirjeldatav järgmise skeemiga :
, kus I0 - pealelangenud kiirguse intensiivsus; d - valgust neelava kihi paksus; I1 - paksusega d neelava kihi läbinud kiirguse intensiivsus.
Valguse neeldumise mõõtmiseks kasutatakse kahte erinevat, kuid omavahel seotud parameetrit:
1. T - Läbilaskvus (transmittance) , mida väljendatakse protsentides.
2. A - Absorbtsioon (absorbance), mis on seotud I ja I0–ga ning T-ga järgmiselt:
Absorbtsiooni mõõtühikuks on AU ehk absorbtsiooni ühik. 1 AU puhul väheneb lahust läbides valguse inetnsiivsus 10 korda, 2 AU puhul 100 korda jne.
Läbilaskvus ja absorbtsiooni arvvärtused on seotud järgnevalt:
Lambert - Beeri seadus.
Valguse neeldumise seadus avastati erinevates vormides üksteisest sõltumatult mitmete teadlaste poolt: Pierre Bouguer 1729; Johann Heinrich Lambert 1760 ; August Beer 1852 .
Käesoleval ajal tuntakse valguse neeldumise seadust Lambert-Beeri seadusena:
, kus c on lahustunud aine molaarne konsentratsioon,  on lahuse neeldumis- ehk ekstinktsioonikoefitsient, d - valgust neelava kihi paksus ehk optilise tee pikkus sentimeetrites.
Lambert-Beeri seaduse kohaselt on valguse absorbtsioon mingi aine lahuses võrdeline lahustunud aine molaarse kontsentratsiooniga .
Läbilaskvuse - T kaudu väljendatuna näeb Lambert-Beeri seadus välja nõnda:

Bradfordi meetod valgu kontsentratsiooni määramiseks

Bradfordi meetod on väga populaarne valgu kontsentratsiooni määramise meetod, kuna see on lihtne, kiire, odav ning tundlik. Meetod baseerub orgaanilise värvaine - Coomassie brilliant blue G-250 (CBBG) (Joonis 1) ja valgu vahelise kompleksi kolorimeetrilisel detekteerimisel.
Joonis 1. Coomassie brilliant blue G-250 struktuur
Molekulaarsel tasemel põhineb Bradfordi meetod Coomassie Blue G-250 erinevalt protoneeritud vormide vahelisel tasakaalul ja selle nihutamisel CBBG valgukompleksi poolt.  Kahekordselt protoneeritud CBBG kogulaeng on +1, see vorm esineb tugevalt happelises keskkonnas ja on punase värvusega (λmax470 nm).  Ühekordselt protoneeritud CBBG kogulaeng on 0, see vorm on roheline (λ max = 650 nm). Täielikult deprotoneeritud CBBG kogulaeng on -1, see vorm on sinine (λ max = 590 nm). Valguga seostub peamiselt deprotoneeritud anioonne CBBG- vorm, mis lisandudes lahuses esinevale tasakaalulisele CBBG- vormile suurendab totaalse CBBG- vormi kontsentratsiooni lahuses ja seega ka valguse neelduvust lahuses 590 nm juures.
                                                                                         + Valk
[CBBG2- ∙ 2H+]+ ↔ [CBBG2- ∙ H+]0 + H+ ↔ CBBG- + H+ ↔ [CBBG- ∙ Valk]
Punane            Roheline         Sinine              Sinine-CBBG∙Valk
(λmax470 nm)            (λmax 650 nm)              (λmax 590 nm)                   (λmax 590 nm)
CBBG sisaldab kuut fenüülijääki ja kaht sulfoonhappe jääki ning seostub spetsiifiliselt valgus esinevate positiivselt laetud (Arg, Lys, His), kuid ka aromaatsete (Trp, Tyr, Phe) aminohappejääkidega.
CBBG- moodustab mittekovalentse kompleksi valkudega, mis suurendab valguse absorbtsiooni 590 nm piirkonnas. Kuna CBBG kontsentratsioon on tunduvalt suurem valgu kontsentratsioonist, siis suureneb lahuse absorbtsiooni 590 nm piirkonnas võrdeliselt valgu kontsentratsiooniga (Joonis 2).
Joonis 2. 1) Bradfordi reagendi spekter
2) Bradfordi reagendi inkubeeritud valguga spekter.
Värvi – valgukompleksi absorptsiooni mõõdetakse 595 nm juures. Seejärel koostatakse kaliibrimiskõver valgustandardi lahjendusrea absorptsiooni tulemuste põhjal. Saadud kaliibrimiskõvera kaudu saab määrata uuritava valgu kontsentratsiooni.
Standardvalk.
Standardvalguks sobib mingi odav valk, millest on võimalik võtta täpne kaalutis ning teha kindla kontsentratsiooniga lahus. Siiski standardvalgu valik mõjutab oluliselt katse tulemust. Originaaltöös kasutati valgustandardiks BSA-d ( bovine serum albumine), mis on jäänud laialdaselt kasutusse. Siiski on täheldatud, et BSA annab tugevama värvimuutuse, kui enamik valke, mistõttu võivad BSA abil määratud valgu kontsentratsioonid olla kõrgemad tegelikust. Tihti kasutatakse valgu standardiks ka immunoglobulin G-d (IgG).
Mõõtepiirkond:
Bradfordi meetodil on võimalik määrata valgu kontsentratsiooni vahemikus 100-1,500 µg/ml Bradfordi mikromeetodil on võimalik määrata valgu kontsentratsiooni 1-25 µg/ml.
Segavad reagendid.
Bradfordi meetodit ei sega enamus reagente (e.g. sahharoos , urea, glütserool, taandavad reagendid ja tioolid ), kuid segavad detergendid (e.g. > 0.1% SDS and > 1% Triton series) või rakulised lipiidid , mis suurendavad CBBG lahuse absorbtsiooni 590 nm juures.
CBBG seostub tugevasti kvartsküvettide seintele , mistõttu on soovitav kasutada klaas või plastikküvette.
Reaktiivid
Terve grupi peale:

• 5x Bradfordi reagendi varulahus (0,01% (w/v) CBBG, 4,75% (v/v) etanool, 8,5 % (v/v) fosforhape )
  

Iga väikse grupi peale:

• 200 l 1 mg/ml BSA lahus
  
• 200 l 5M NaOH
  
• mQ vesi
  
• 100 l uuritav valgulahus – proov nr
  

Töö käik

Bradfordi reagent : Lahusta 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 50 ml 95% ethanoolis, lisa 100 ml 85% (w/v) fosforhapet. Kui reagent on täielikult lahustunud, lahjenda 1 liitrini ja filtreeri lahus läbi Whatman #1 paberfiltri. Reagent peab olema värvuselt pruun. Korduv filtreerimine aitab eemaldada sinist komponenti. Külmas säilitatuna on reagent väga stabiilne (1 aasta).

1 M NaOH lahus, kasutatakse juhul, kui valk pole lahustuv värvaine lahuses.

Tee standardvalgu (BSA) lahjenduste rida:
1 mg/ml
0,5 mg/ml
0,2 mg/ml
0,1 mg/ml
0,05 mg/ml

Terve grupi peale on antud 5x Bradfordi reagendi stock . Lahjenda see 25 ml-s, et oleks 1x stock. 25 ml kohta lisa 100 l 5M NaOH. Lahustina kasuta mQ vett.

Pipeteeri igasse eppendorfi 1,5 ml 1x Bradfordi reagenti ning lisa 50 l BSA valgulahust erineva kontsentratsiooniga. Viimasesse eppendorfi pipeteeri samuti 1,5 ml 1x Bradfordi reagenti ning lisa 50 l uuritava valgulahust tundmatu kontsentratsiooniga. Sega korralikult. Lase reaktsioonil toimida 10 minutit. Sellel ajal seadista spektrofotomeetrit.

Iga grupi peale on 1 spektrofotomeeter, milles on 578 nm või 546 nm filter . Kõigepealt lülita sisse seade (AusEin). Seejärel oota u. 10 minutit, et aparaat soojeneks. Siis pane paika nulli (nulleinstellung). Kui null on paigas, vajuta musta nuppu kaasa kõrval ning pane paika veelkord nulli (dunkeleinstellung). Viimane nupp suleb kiire ava ning siis on võimalik seadistada nulli, kui läbilaskvus T=0. Nüüd on aparaat valmis mõõtmiseks.

Pipeteeri puhta küvetti 1,5 ml 1x Bradfordi reagenti. Küveti panemiseks vajuta musta nuppu kaasa kõrval, ava kaas, paiguta küvett ning sule kaas. (NB! Must nupp peab olema kogu protseduuri vältel vajutatud, see pikendab aparaati eluiga!). Nulli näit ära nupuga nulleinstellung.

Pese küveti ning pipeteeri sisse 1,5 ml reaktsioonisegu. Mõõda absorptsiooni, loe numbriline näit skaalast ning pane endale kirja. Korra protseduuri kuni kõik lahused (k.a. tundmatu valgu kontsentratsiooniga reaktsioonisegu) on ära mõõdetud. Alusta kõige väiksemast kontsentratsioonist. Enne kontrollvalgu lahuse mõõtmist pese küvett ära etanooliga. Kui kõik mõõtmised on tehtud, lülita seade välja (EinAus).
Töö tulemused
proov
kontsentratsioon
absorptsioon
1
1 mg/ml
0,51
2
0,5 mg/ml
0,47
3
0,2 mg/ml
0,43
4
0,1 mg/ml
0,38
5
0,05 mg/ml
0,36
6
tundmatu
0,49
Kaliibrimiskõvera järgi võib öelda, et tundmatu valgu kontsentratsiooniks oli 0,75 mg/ml.
Viited:
1. Bradford , M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254.
2. Compton SJ, Jones CG. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay . Anal. Biochem. 1985 Dec;151(2):369-74