Elektroforeesi aparaadi kokku panemine (0)

Praktiline töö nr. 2: SDS-PAGE elektroforees
NB! Geeli valmistamisel kasutasime akrüülamiidi, mis on tervisele kahjulik, seetõttu töötasime kummikinnastega.
Elektroforeesi aparaadi kokku panemine

Geelikihtide valmistamine:
1. Valmistada lahutav geel (resolving gel) (10%), mis koosneb järgmistest komponentidest:
Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8%
3,3 ml
4x lahutava geeli puhver (1,5M Tris-Cl, pH 8,8)
2,5 ml
10% SDS
0,1 ml
mQ
4,0 ml
APS
70 µl
TEMED
7 µl
Segasime omavahel antud järjekorras kokku:

• vesi
  
• 4x lahutava geeli puhver
  
• SDS-i 10% lahus
  
• akrüülamiid/bisakrüülamiidi lahus
  
• Viimastena lisasime TEMED tõmbe all (ebameeldiva kalmaitselise lõhna pärast) ja seejärel APSi, mis katalüüsivad polümerisatsioonireaktsiooni.
  

2. Valasime alumist – lahutavat geeli – kahe klaasplaadi vahele. Geeli lahust plaadidevahelise ruumi täitsime nii, et ülemise ääreni jääks ~2 cm ruumi. Jälgisime, et ei tekkiks õhumulle. Kandsime geelile 1 ml EtOH. Lasesime geelil tarduda (8-15 min). Selleks, et jälgida geeli tardumist(polümeriseerumist), kasutasime falkooni: kui falkoonis ülejäänud geel on tardunud, võib teha järgmist etappi (etanooli visata ära ja kontsentreeritava geeli peale valada)
3. Valmistada kontsentreeriva geeli (stacking gel) lahus (NB! Kui lahutav geel on polümeriseerunud):
Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8%
0,67 ml
4x kontsentreeriva geeli puhver (0,5M Tris-Cl, pH 6,8)
1,25 ml
10% SDS
50 µl
mQ
3 ml
APS
40 µl
TEMED
4 µl
Segasime omavahel antud järjekorras kokku:

• vesi, 4x kontsentreeriva geeli puhver
  
• SDS-i 10% lahus
  
• akrüülamiid/bisakrüülamiidi lahus
  
• Viimastena lisasime TEMEDit tõmbe all ja APSi, mis katalüüsivad polümerisatsioonireaktsiooni.
  

4. Valasime kontsentreerivat geeli lahutava (alumise) geeli peale ning panime paika kammi (ettevaatlikult). Jätsime geeli polümeriseeruma.
5. Sellel ajal valmistasime proovid ette. Segasime omavahel valgulahust ja 2x laadimispuhvrit (15 µl : 15 µl). Inkubeerisime denatureerimiseks 95oC juures 5 minutit. Jahutasime jäävannis.
6. Proovide jahutamise ajal asetasime geel foreesiaparaati. Täitsime puhvrikambrid jooksupuhvriga (0,25 M TRIS, 1,92 M glütsiin, 0,1% SDS, pH 8,3), eemaldasime ettevaatlikult kammi ning pesime moodustunud geelitaskutest välja polümeriseerumata geelilahuse jäägid (kasutades jooksupuhvrit ja süstalt).
Forees
1. Kandsime ettevalmistatud valguproove ettevaatlikult geelitaskutesse (20 l). Protokollisime, millisesse taskusse , millise proovi kandsid.
2. Asetasin foreesivannile kaasi , ühendasime juhtmed vooluallikaga ning lülitasime vooluallikas sisse (pinge 180V, voolutugevus 30 mA).
NB! Täida elektriaparaatidega töö ohutuseeskirjasid!
3. Foreesi viiakse läbi üldjuhul niikaua, kuni markerina kasutatav broomfenoolsinine on geeli lõpuni jõudnud (tavaliselt ~1 tund 180 V juures). Elektroforeesi kulgu tuleb jälgida ning tuleb veenduda, et geel üle ei kuumeneks (alanda pinget 150V-ni).
4. Lülitasime foreesiaparaat elektrivõrgust välja, kogu puhvrivannidest puhver kokku ja valasime tagasi puhvri pudelisse, võtsime geeli aparaadist välja, eraldasime klaasplaadid teineteisest väga ettevaatlikult kasutades väikest spaatlit.
5. Panime geeli ööseks Coomassie G250 värvilahusesse.
6. Saime elektroforeesi tulemust :
Lahtrites vasakust paremale :

Marker

BSA (Mw = 66,5 kDA)

Trypsin (Mw =23,8 kDA)

Lactate dehüdrogenase ( Mw = 35 kDA)

Tundmatu

Albumin (Ovalbumin) (Mw = 44,3 kDa)

Proteinase K ( Mw = 28,5 kDa)
Valk
Migreerumistee pikkus (cm)
Mw (kDA)
BSA
2.9
66.5
Albumine
4.6
44.3
Lactate dehydrogenase
5.2
35
Proteinase K
5.7
28.5
Trypsin
6.5
23.8
Tundmatu
6.2
Geeli pikkus (cm)
7.4
 
Kalibreerimisgraafik :
Y=Mw
X=migreerimispikkus
Y= -12.351*6.2 + 101.13 = 24.55
Vastus: meie valgu kontsentratsioon on 24.6 kDa