Praktiline töö - SDS-PAGE PROTEOOMIKA (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
MATEMAATIKA -LOODUSTEADUSKOND
Geenitehnoloogia instutuut
Praktiline töö nr. 2 SDS-PAGE
Protokoll
Koostaja :
XXXXXX
Juhendajad:
Katrina Laks , Merlin Friedemann
Tallinn, 2015.a
Teoreetiline osa.
Elektroforees on makromolekulide eraldamine elektrivälja toimel. SDS-PAGE (naatrium-dodetsüül sulfaat polüakrüülamiid geel elektroforees) on laialdaselt kasutatav valkude elektroforeetilise eraldamise meetod, kus valkude denatureerimiseks kasutatakse SDS-i.
SDS (ka laurüül sulfaat) on anioonne detergent , mis seostub valgumolekulidega ja annab molekulidele negatiivse kogulaengu ning elektriväljas liiguvad nad anoodile (positiivselt laetud elektrood ).
Polüakrüülamiid geel piirab molekulide migreerumiskiirust, kusjuures väiksemad molekulid liiguvad kiiremini, kui suuremad molekulid. Kuna massi ja laengu suhe on erinevatel SDS- denatureeritud polüpeptiididel peaaegu sama, toimub erinevate valkude eraldamine polüpeptiidide molekulmasside alusel.
SDS-PAGE abil valkude eraldamist saab kasutada: valkude suhteliste molekulmasside hindamiseks, valkude sisalduse määramiseks proovis, valguproovide puhtuse hindamiseks, valkude puhastamise ja fraktsioneerimise jälgimiseks .
Denaturatsiooniks kasutatav detergent SDS lagundab natiivseid valke, lõhkudes valkudel nii sekundaar - ja tertsiaarstruktuuri kui ka kvarternaarstruktuuri.
Polüpeptiidide omavaheline kovalentne seondumine vähendab valguproovi analüüsi täpsust, kuna sama molekulmassiga bändid võivad sisaldada ühte polüpeptiidi või dimeeri/terrameeri. Taolise probleemi ärahoidmiseks kasutatakse proovi ettevalmistamise käigus redutseerivat agenti dithiothreitol (DTT või Clealand`i reagent ) või 2-merkaptoetanooli (2-ME). Redutseerivates tingimustes lagunevad disulfiidsidemed ning disulfiidseotud valkude oligomeerid algunevad.
„Plaat” geeli vorm koosneb kahest paralleelsest klaasplaadist või plastiklehest, mille vahele on asetatud tihendid (spacerid) vahemiku tekitamiseks ning geeli äravoolu takistamiseks servadest.
SDS-PAGE elektroforeesi puhul kasutatakse kihilist kahe geeli kombinatsiooni . Esmalt valatakse kahe plaadi vahele lahutav geel ning järgnevalt kontsentreeriv geel. Kontsentreerivasse geeli asetatakse enne polümeriseerumist kammid , mille abil tehakse geeli taskud proovide jaoks. Lahutav ja kontsentreeruv geel erinevad puhvri konsentratsiooni ja pH poolest.
Pinge sisselülitamisel liiguvad anioonid anoodile (alumine elektrood) ning katioonid katoodile (ülemine elektrood). Kui peenike joon liigub lahutava geelini algab eraldumine üksikuteks bändideks väga kõrge resolutsiooniga. Iga bänd vastab ühele või mitmele polüpeptiidi tüübile , mis omavad sarnast molekulmassi.
Mida raskem makromolekul seda rohkem on tema liikumine takistatud. Kui proov tungib läbi lahutava geeli toimub eraldumine nn. bändideks, kusjuures raskemad polüpeptiidid jäävad ülemissse ning kergemad geeli alumisse osasse. Iga bänd sisaldab ühte või mitut polüpeptiidi sama või erineva molekulmassiga.
Valkude detekteerimiseks polüakrüülamiidi geelist kasutatakse tavaliselt 0,1 % Coomassie Blue nimelist värvi 50 % metanoolis ja 10 % äädikhappe Lahuses. Happeliseks muudetud metanool sadestab valke. Värvimist teostatakse tavaliselt üleöö. Värv tungib läbi kogu geelist, kuid värvuvad siiski ainult valgud .
Figure 1 Foreesiaparaat

Praktiline osa.
Geelikihtide valmistamine:
1. Valmistasime lahutava geeli (resolving gel) (10%). Selleks segasime omavahel antud järjekorras kokku:

• mQ – 4,0 ml
  
• 4x lahutava geeli puhver (1,5M Tris-Cl, pH 8,8) – 2,5 ml
  
• SDS-i 10% lahus – 0,1 ml
  
• Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8% lahus – 3,3 ml
  

Polümerisatsioonireaktsiooni katalüseerimiseks:

• TEMED – 7 µl tõbmekapi all
  
• APS – 70 µl
  

2. Valasime alumise – lahutava geeli – kahe klaasplaadi vahele nii, et ülemise ääreni jäi ~2 cm ruumi. Kontrollisime, et õhumulle ei tekkinud. Kandsime geelile 1 ml EtOH ning ootasime kuni geel tardus (8-15 min) jälgides polümeriseerumist külili asetatud falkonis.
3. Valmistasime kontsentreeriva geeli (stacking gel) lahus, selleks segasime omavahel antud järjekorras kokku:

• mQ – 3 ml
  
• 4x kontsentreeriva geeli puhver (0,5M Tris-Cl, pH 6,8) – 1,25 ml
  
• SDS-i 10% lahus – 50 µl
  
• Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8% lahus – 0,67 ml
  

Polümerisatsioonireaktsiooni katalüseerimiseks:

• TEMED – 4 µl tõmbekapi all
  
• APS – 40 µl
  

4. Valasime kontsentreeriva geeli lahutava geeli peale, eelnevalt kontrollides lahutava geeli polümeseerimist, ning ettevaatlikult panime paika kammi. Jätsime geel polümeriseeruma.
Vlaguproovide valmistamine:
1. Segasime omavahel valgulahus ja 2x laadimispuhver, mille komponendiks on broomfenoolsinine – värv, mis aitab jälgida proovide migreerumist (15 µl valgulahus + 15 µl laadimispuhvri) eppendorfis.

Trüpsin
23,8 kDa

EPGluC
29 kDa

Laktaat dehüdrogenaas
35 kDa

HRP
44 kDa

Ovalbumiin
44,3 kDa

BSA
66,3 kDa

Tundmatu valk
X kDa
2. Inkubeerisime denatureerimiseks 95oC juures 5 minutit.
3. Jahutasime valguproovid jäävannis.
4. Raputasime eppendorvid, et saada valgutilgad põhjale.
Foreesiaparati asetamine:
Proovide jahutamise ajal asetsime geel foreesiaparaati. Seleks täidsime puhvrikambrid jooksupuhvriga (0,25 M TRIS, 1,92 M glütsiin , 0,1% SDS, pH 8,3) ning eemaldasime kammi.
Forees:
1. Igasse taskusse kandsime 20 µl valguproovi. Viimasse taskusse panime 3 µl foreesredeli - Thermo Scientific PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder.
2. Asetasime foreesivannile kaas, ühendasime juhtmed vooluallikaga ning lülitasime vooluallikas sisse (pinge 150V, voolutugevus 30 mA).
3. Jätsime foreesiaparaati üheks tunniks kuni markerina kasutatav broomfenoolsinine on geeli lõpuni jõudnud.
4. Lülitasime foreesiaparaati elektrivõrgust välja, kogusime puhvrivannidest puhver kokku ja valasime tagasi puhvri pudelisse.
5. Võtsime geeli aparaadist välja, ettevaatlikuslt eraldasime klaasplaadid teineteisest.
6. SDS-i eemaldamiseks pesime geeli veega 10 minutit, loksutasime geeli veega, vahetades vett 10 min jooksul 3 korda.
7. Panime geel ööseks Coomassie G250 värvilahusesse.
8. Valasime värvilahus tagasi purki. Seleks, et bändid taustast ilusasti eristuksid geeli pesti korduvalt veega.
9. Pildisasime geeli.
Tulemused :
Figure 2 Geelipilt
Geelipildi analüüsiks kasutasin Paint programmi. Kuna EPGluC bändi asukoht on kahtlane, kalibreerimisgraafiku koostamiseks kasutasin redeli bände. Leidsin iga bändi asukoha, kasutades navigaatori, sellega sain nende migreerumisteepikkused (pixelites).
Kandsin tulemused tabelisee :
Migreerumisteepikkus, px
Molekulide mass, kDa
20
200
38
150
76
100
113
70
156
50
188
40
245
30
310
20
393
15
414
10
Tabeli põhjal koostasin kalibreerimisgraafiku Excel programmis , ning kasutades trendline funktsiooni leidsin graafiku võrrandi. Graafiku võrrand on y = 174.67e-0.007x , kus y on mass, x on pixelid.
Teades, et tundmatu valgu migreerumisteepikkus on x=270 px, arvutan teda massi:
y = 174.67e-0.007*270 = 26.4 kDa.
Graafiku järgi tundmatu valgu mass on 26.4 kDa.
Graafik 1 Kalibreerimisgraafik