Lipiidid reaktsioonide ja karotenoidide identifitseerimise protokoll 2020 (0)

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID  Protokoll   
 
 
 
 
 
   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 


 
Sissejuhatus 
 
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab                     enamasti estersidemete esinemine. Reeglina ei lahustu lipiidid vesilahustes, kuna lipiidide                     molekulid sisaldavad hüdrofoobseid aatomirühmasid ja pikkasid süsivesinikradikaale. Lipiidid                 lahustuvad apolaarsetes orgaanilistes solventides ja vähemal määral lahustuvad lipiidid                   polaarsetes solventides. Lipiidid on organismides rakumembraanide koostiskomponendiks               ning energeetiliseks varuaineks. Lisaks on neil kaitse- ja regulatoorsed funktsioonid.  
 
Lipiide klassifitseeritakse vastavalt molekuli ehitusele ja omadustele järgmiselt: rasvhapped,                   rasvad, glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad, steroidid, terpenoidid. Lipiide jaotatakse ka                   seebistuvateks ja mitteseebistuvateks. Vastavalt molekuli struktuurile jaotatakse lipiide veel                   liht-, liit- ja tsüklilisteks lipiidideks. 
 
Töö käik 
 
1.3.1 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides  Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse reaktsiooni               halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sialdava proovi reaktsioonil broomiga broomi                 iseloomulik pruun värvus ei kao, aga küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus                         toimuva liitumisreaktsiooni tõttu värvituks.  
Valasin kolme katseklaasi 2ml erineva lipiidi: palmithappe, rapsiõli ja searasva lahust                       orgaanilises lahustis. Lisasin kõikidesse katseklaasidesse 5 tilka broomi lahust kloroformis ja                       loksutasin. Palmithapet sisaldavas katseklaasis säilis broomi pruun värvus, aga rapsiõli ja                       searasva sisaldavates katseklaasides muutus lahus kohe värvituks. Sellest võib järeldada, et                       taime- ja loomarasva sisaldavas katseklaasis toimus broomi liitumine kaksiksidemele ehk ​nii                       rapsiõli kui ka searasv sisaldavad küllastumata rasvhappeid ​. Palmithapet sisaldavas                   katseklaasis säilis broomi iseloomulik värvus, sest halogeenil ei olnud kuskile liituda ehk                         palmithape on küllastunud rasvhappeid ​.    
1.3.2 Liebermann-Burchard’i kolesterooli määramise test  Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga väävelhappe keskkonnas moodustub               tume sinakas-rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise               reaktsiooniga ning reaktsiooni käigus tekivad punane ja sinine vaheühend. Kolesterooli                     molekulis leiab aset palju transformatsioone.  
Valasin kolme katseklaasi 2ml erineva lipiidi: kolesteroolilahus, oliiviõli ja searasva lahust.                       Lisasin 6 tilka äädikhappe anhüdriidi ja 4 tilka kontsentreeritud väävelhapet ning loksutasin.                         Kolesteroolilahus omandas heleda sinakas-rohelise värvuse ja oliiviõli lahus tumeda                   sinakas-rohelise värvuse. Searasva lahus värvus veidi kollakaks. Kuna kõikide lahuste                     värvus muutus väiksemal või suuremal määral, võib järeldada, et kõik lahused sisaldasid                        


mingil määral kolesterooli. Oliiviõlis sisalduvad fütosteroolid võisid põhjustada taimerasva                   positiivse reaktsiooni kolesterooli määramisel.   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 


 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE  MÄÄRAMINE  Protokoll   
 
 
       
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
   


  Sissejuhatus 
 
Taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides sisalduvad fotosünteesi abipigmentidena               karotenoidid, mis on täiendavateks kiirguse retseptoriteks. Lisaks täidavad karotenoidid ka                     kaitsvat rolli neelates liigset valgusenergiat. Karotenoidid on väga arvukas ühendite rühm                       ning neid klassifitseeritakse keemilise ehituse poolest kui tetraterpenoide (40 süsiniku                     aatomit). Struktuurilt on karotenoidid polüeensed aheldad, mille ühes või mõlemas otsas on                         reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid.  
 
Karotenoidide kaks põhigruppi on:  ● Karoteenid - hapnikku mittesisaldavad molekulid 
● Ksantofüllid - hapnikku sisaldavad molekulid   
Loomsed organismid ise karotenoide ei sünteesi ning neid tuleb omastada taimse toiduga.                         Karotenoidide imendumiseks peavad need vabanema taimerakkudest ja konjugeeruma                 sapphapetega.  
 
Kõik karotenoidid on värvilised ning nende värvus varieerub kollasest üle oranži                       tumepunaseni. Mida rohkem karotenoid neelab valgust spektri nähtava osa lühematel                     lainepikkustel ja peegeldab pikematel lainepikkustel, seda intensiivsem on selle värvus.                     Karotenoidide võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas tuleneb nende molekuli                     ehitusest, mida iseloomustab polüeensus.   
 
Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab objektiivselt iseloomustada                   neeldumisspektri järgi, mis kujutab endast absorptsiooni sõltuvust uuritavat lahust läbiva                     valguse lainepikkusest. Kui proov sisaldab üheaegselt erinevaid karotenoide, võib                   neeldumisspekter muutuda.  
 
Töö käik 
  1. Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist  Eelpeenestasin oma uuritava proovi, milleks olid astelpajumarjad, noaga väikesteks                   tükkideks. Kaalusin tehnilistel kaaludel proovi suurusega 0,53g 50ml tuubi. Lisasin                     tõmbekapi all 15ml petrooleetrit ning peenestasin materjali homogenisaatoriga ~2minuti                   jooksul. Selle protsessi käigus ekstraheerusid karotenoidid taimsest materjalist apolaarsesse                   solventi. Peale massi peenestamist lisasin segule vee sidumiseks ~1 teelusika Na2SO4,                       loksutasin ja jätsin ~5 minutiks seisma.  
Seejärel filtrisin ekstrakti 50ml mõõtsilindrisse, kuhu olin paigutanud klaaslehtri ja paberfiltri.                       Filtreerimine toimus dekanteerides. Lisasin tuubi veel 5ml petrooleetrit, segasin vortexil ja                       filteerisin, kordasin seda sammu. Mõõtsin filtraadi mahu, milleks oli 18ml.  
 
 
 


2. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs  Nullisin spektrofotomeetri petrooleetriga ja mõõtsin lahuse neeldumisspektri lainepikkuste                 vahemikus 350-650nm. Neeldumisspektrilt eristusid selgelt kaks neeldumismaksimumi:               lainepikkusel ​ 473nm A=1,0490 ning lainepikkusel ​ 449nm A=1,1406. Kolmas                 neeldumismaksimum lainepikkusel ​424nm A=0,8688 on määratud kursori nihutamisega,                 mistõttu see ei pruugi anda kõige tõesemat tulemust.  
    Neeldumisspekter   
Võrdlesin uuritava lahuse neeldumisspektril esinenud neeldumismaksimumide             lainepikkuseid teatmeteostes leiduvate andmetega ning minu katsetulemustega klapivad                 kõige paremini zeaksantiini ​neeldumismaksimumid 423;451;483 või violaksantiini               neeldumismaksimumid 420;444;474. Otsisin infot ka internetist ja leidsin, et                   astelpajumarjades sisaldub siiski ​zeaksantiin​. 
  3. Karotenoidi sisalduse arvutamine  Karotenoidi sisalduse määramiseks uuritavas proovis kasutatakse neeldumisspekri               analüüsimisel saadud andmeid - neeldumismaksimumidele vastavaid absorptsiooni               väärtuseid. Reeglina võetakse arvutamisel aluseks selline absorptsiooni väärtus, mis vastab                     neeldumisspektril kõige kõrgemale „tipule“ - minu töö puhul on selleks lainepikkusel 449nm                         mõõdetud ​A=1,1406 ​. Arvutus põhineb nimetatud lainepikkusele vastava A väärtuse ja samal                       lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele. 
 
 
 


Karotenoidi sisaldus (K,mg %) uuritavas proovis arvutatakse järgmisest valemist: 
 
K=(A*V*d*10 ​^3)/(E*m)   
A – absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile max 
(kõrgeimale „tipule“ vastav A väärtus) 
E(1cm1%) – vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse 
absorptsioon) sama max juures 
V – lisatud solvendi maht, ml 
d – kasutatud ekstrahendi tihedus g/cm3  
m – uurimiseks võetud taimse materjali mass, g 
10​^​3 – tegur milligrammidele üleminekuks 
 
K=(1,1406*18ml*0,72g/cm​^3​*10​^3)/(2350*0,53g)=​11,87mg % 
 
Kokkuvõte 
Antud laboratoorse töö käigus määrasin karotenoidide sisaldust astelpajumarjas. Katse                   käigus mõõdetud neeldumismaksimumide põhjal järeldasin, et astelpajumarjas sisaldub                 zeaksantiin ning edasiste arvutuse tulemusel oli zeaksantiini sisaldus uuritud                   astelpajumarjas 11,87mg %. Leidsin internetist, et peamised astelpajumarjades sisalduvad                   karotenoidid on ​β-karoteen, zeaksantiin ja lükopeen. ​Antud artiklist leidsin, et zeaksantiini                       sisaldus astelpajus on 11mg/100g.