Graafikult on näha kolme tõusu ja langust, mis näitavad, et aine konts. kolonnist väljumisel tõuseb, saavutab haripunkti ja langeb, kuni kogu aine on kolonnist väljunud. Ained jagunesid geelis vastavalt molaarmassile. Dekstraansinine, mille molaarmass oli suurim, väljus kolonnist esimesena. Tema elueerumismaht on minimaalne. Kolmandana elueerus DNP- aspartaat, mille molekulid olid lahuses väikseimad ning difundeerusid täielikult geeli pooridesse. Seetõttu on DNP-Aspartaat maksimaalse elueerimismahuga. Müoglobiin väljus kohe pärast dekstraansinist, st tema molekulmass on dektraansinisest veidi väiksem. Müogobiini ja DNP-aspartaadi väljumise vahe oli suurem, st DNP-aspartaadi molekulid on oluliselt väiksemad müoglobiini omadest. eluaadi kogumaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx1= Vxmin= 33 +22= 37 ml eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx2= 33 + 2 8= 49 ml
maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t) Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi
Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Kolonni elueerimine Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 42,165/2≈21. Võtsin 21 kaliibritud katseklaasi Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 1 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti), selle kogusin 50 ml kuiva kolbi
elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiga koguda iga fraktsioon umbes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin automaatpipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. · Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiks koguda iga fraktsioon ubmes 2-3 minutiga). Proovi sisestamine ja kolonni voolutamine: · Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti. Võtsin 0,5 ml uuritavat segu ja tilgutasin geeli pinnale. · Alguses kogusin ühendatud fraktsiooni (sest kuni kolonni alaossa jõuab kõige
Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku. Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama. Proovide ettevalmistamine ja sisestamine Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised. Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast. Kolonni elueerimine Enne voolustamise alustamist asetakse 100ml kuiv kooniline kolb väljalaskeava alla ja avatakse väljavool kolonnist. Mõne sekundi järel avatakse kolonni ja reservuaari vahel olev kraan.
Pundumistegur k 0,1 Täidise kõrgus L 31,5 cm Kolonni sisediameeter d 1,8 Täidise kogumaht ( ) Geelmaatriksi maht Maksimaalne elueerimismaht Fraktsioonide üldarv Dekstraansinine Uuritav segu Müoglobiin DNP-aspartaat pH 7,5 Elueerimislashus 0,05 M Tris/HCl 0,1 M NaCl Laine- Fraktsiooni Eluaadi Optiline pikkus järjekorra maht V tihedus (nm) nr (ml) Ühendfrakt. 23,5 0 670 1 25,5 0,025
3) Seejärel arvutatakse kolonni kogumaht Vt= r2h= 3,14*(2,4/2)*22,6=85,15 cm3 4) k=0,1 5) Seejärel arvutatakse geelmaatrikis maht Vg=k*Vt = 85,15*0,1=8,51cm3 6) Vg lähtuvalt arvutatakse max elueerimismaht Vx max=Vt-Vg=85,15-8,51=76,64 cm3 7) Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml, seega n= Vx max /2= 76 /2=38 Esimese elueerimismaht oli 15 ml Optilise tiheduse table Dekstraansinine Müoglobiin DNP-aspartaat 670nm 410 nm 360nm 0,011 0,129 0,166 0,335 0,612 0,542 0,484 1,683 1,555 0,329 1,999 2,636 0,154 1,171 3,179
Maksimaalne elueerimismaht selline elueerimismaht, mille juures kolonnist väljuvad ka need molekuli, mille molekulid täielikult diffundeeruvad geeli pooridesse (=). Aineid, mille molekuli suudavad täielikult diffundeerida geeli pooridesse ja mille antud kolonnis on teada, iseloomustatakse liikuvusteguriga : Selle värtusedjäävad vahemiku 0...1 Töö käik 1. Proovi andmed: =0.5 ml. Koostis: Dekstraansinine (6 mg/ml), Müoglobiin (6 mg/ml), DNP-aspartaat (0.3mg/ml), proovi lahusti ja eluent NaCl lahus. 2. Märgin ära kolonni andmed: geel on Sephadex G-75, koeffitsient k=0.1, geelisambla kõrgus L=27.4 cm, diameeter d=1.9 cm. 3. Arvutan vajalikud mahud: ; ; 4.Arvutan fraktsioonide üldarv: n= (tegelikult 29-s fraktsioonis oli nii vähe elueerivat ainet, et sellega ma lõpetasin fraktsioonide kogumist). 5. Asetan katseklaase statiivi ja nummerdan neid. 6
L=32,5 cm. d=1,9 cm. · Arvutan täidise kogumaht Vt . · Arvutan geelimaatriksi maht Vg . · Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml. n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42 · Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. · Voolutuslahus:Dekstraansinine,Müoglobiin,DNP-Aspartaat.Kasutasin automaatpipetti mahuga 0,5 ml. · Kolonni pinnal olev eluent kogun seisukolbi. Segu komponentide lahutamine: Avan kolonni väljavooluava. Täidise lahus hakkab keeduklaasi tilkuma. Reguleerin kolonni voolukiirus piiridesse 0,7-1,0 ml/min. Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan kolonni väljavooluava . Uuritav segu: 1.segu: Dekstraansinine (sinine), müüoglobiin (punane), DNP-aspartaat (kollane). Proovi sisestamine:
Nüüd oli kolonn valmis proovi sisestamiseks. Proovi sisestamine Võtsin pipetiga 1 mL uuritavat proovi ja viisin selle kolonni. Selleks juhtisin pipeti otsa vastu kolonni seina ja lasin proovil voolata geeli pinnale nii, et geel saaks võimalikult ühtlaselt kaetud. Uuritav segu Uuritav segu koosnes kolmest erineva molekulmassiga komponendist. Uuritava segu koostisosad: 1) Dekstraansinine, 3 mg/mL 2) Müoglobiin, 6 mg/mL 3) DNP-aspartaat, 0,3 mg/mL Kolonni voolutamine Kui olin proovi viinud geeli pinnale, siis avasin väljavoolutoru ja hakkasin eluaati koguma alguses ühendatud fraktsioonina kuiva kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda. Kordasin sama asja väikese eluendi kogusega veel teinegi kord ja siis viisin juba geeli pinnale nii palju eluenti, et moodustus u 5 cm kõrgune kiht.
Tulemuste põhjal koostati kromatogramm. Tulemused ja nende analüüs Täidise mark: SEPHADEX G-75 Pundumistegur k = 0,1 Täidise kõrgus L = 32,5 cm Kolonni diameeter d = 2,1 cm r =1,05 Täidise kogumaht: Vt= ·r2·L = 3,14 · 1.052 · 32,5 = 112,5 cm3 Geelmaatriksi maht: Vg= 0,1 · 112,5 = 11,25 cm3 Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 112,5 11,25 = 101,26 cm3 Fraktsioonide üldarv: n=101,26 : 2 = 50, 63 51 Uuritav segu: Dekstraansinine 3mg/ml Müoglobiin: 5mg/mol DNP-aspartaat: 0,3 mg/mol Elueerimislahus: pH= 7,4 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl Fraktsiooni nr Lainepikkus, nm Elueerimismaht V, Optiline tihedus, ml A Ühendatud fraktsioon - 23 0 1 670 25 0 2 670 27 0,032 3 670 29 0,163
Eluaadi kogumise lõpetasin, kui see oli muutunud värvusetuks. Fraktsioonide analüüsimine Ainete kontsentratsiooni antud töös väljendatakse igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritava ainesegu koostisest: dekstraansinine- 670 nm, aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (türosiin Tyr, fenüülalaniin Phe, trüptofaan Trp) - 280 nm ja DNP-aspartaat- 360 nm. Katseandmete tabel Fraktsiooni nr Elueerumismaht ml Optiline tihedus, A Ühendatud fraktsioon 16,75 0 1 18,75 0,0961 2 20,75 0,1959 670 nm 3 22,75 0,3551 4 24,75 0,6745 5 26,75 0
Kromatogramm. Kõige esimesena väljus kolonnist dekstraansinine , selle osakesed olid väga suured ja ei mahtunud geeli pooridesse. Dektraansinine on nendest kolmest ainest kõige väiksema molekulmassiga. Dekstraansinise kontsentratsioon uuritavas lahuses oli kõige väiksem. Teisena väljus kolonnist müoglobiin , mille osakesed difundeerusid geeli pooridesse osaliselt. Müoglobiini kontsentratsioon uuritavas lahuses oli kõige suurem. Viimasena väljus kolonnist DNP-aspartaat , sest tema osakesed difundeerusid täielikult geeli pooridesse, mistõttu tema osakesed liikusid kolonnis kõige aeglasemalt. DNP-aspartaat on nendest kolmest ainest kõige suurema molekulmassiga. Arvutuslikult tuli kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima kontsentratsioonida fraktsiooni eluaadi maht , mis on veidi suurem, kui katseliselt saadud tulemus
NB. Mingil juhul ei tohi kolonni kuivaks lasta. 3. Proovi sisestamine. Kolonni lisatakse uuritava proovi (0,5-1,0 ml) 4. Reeglin koosnevad segud 3-4 erineva molekulmassiga komponentidest, mis on lahustunud sobivas lahuses(näitek destileeritud vesi või NaCl lahus). Meie töös ained on värvilisred ja me võime visuualselt jälgida nende lahutamist. Meie lahuse koostises: Dekstraansinine Müoglobii DNP-Aspartaat 5. Kolonni voolutamine. Kuni kollonni allaosa jõuab kõige kiiremini liikub komponent (meie juhul dekstraansinine) kogume eluaadi ühendatud fraktsiooniga ühe kolbi. Pärast esimese komponentide kolonni alla jõudmisel kogume 2 ml kaupa. 6. Fraktsioonide analüüsimine. Meie töös väljendame aine kontsentratsiooni igasfraktsioois lahuse optilise tiheduse järgi. Iga aine absorbeerib erinevatel lainepikkusel. Kasutame spektrofotomeetri meetodi. 7
NB! Õhk ei tohi tungida geelikihti! 4. Kasutan kalibreeritud mõõtpipetti ja viin 1 ml uuritavat proovi kolonni. 5. Lasen proovil tilkuda geeli pinnale nii, et see jaotuks seal võimalikult ühtlaselt. NB! Samal ajal on väljavooluava suletud! Praktikumis uuritavas ainete segus on kõik ained värvilised ja segu komponentide lahutamine on visuaalselt jälgitav. Uuritava segu sisaldus: dekstraansinine + müoglobiin + DNP-aspartaat KOLONNI VOOLUTAMINE: 1. Avan väljavoolu kolonnist 2. Hakkan koguma eeljooksu (puhas vooluti), enne kui kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent (dekstraansinine). 3. Kui proov on täidisesse sisenenud, viin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikese koguse (0,5-1 ml) eluenti 4. Lasen eluendil täidisesse imbuda. 5. Kordan seda protsessi väikeste kogustega seni, kuni kogu uuritav proov on kolonni sisenenud 6
difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm r= 0,8 cm Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP-aspartaat 0,3mg/ml Arvutasin välja: Vt = r2 * L= 3,14 * 0,64 * 25,5 = 51,27 cm3 Vg= k*Vt = 0,1 * 51,27 = 5,127 ml Vx max = Vt Vg = 51,27 5,127 = 46,143 ml N= Vx max /2 = 46,143 /2 = 23,1 tk Pärast ettevalmistuste tegemist avada ettevaatlikult kolonni voolutusava ning kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, siis taas sulgeda kolonni väljavooluava. Kolonn on valmis proovi sisestamiseks.
R f = max V x - V xmin 50 - 40 Rf = 96 - 40 =0,178 JÄRELDUS. Töö õnnestus enam vähem hästi, ainete piir oli üpriski eristatav. Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest. Esimesena väljus kõrgmolekulaarne dekstraansinine, peale seda müoglobiin ja seejärel väikse Mr-ga DNP-aspartaat. Sahharoos oleks tõenäoliselt väljunud umbes ühel ajal DNP- aspartaadiga kuna mõlemad on madalmolekulaarsed. Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramiseks mõõdetud kõrguse ja diameetri leidmisel tehtud veast. Suurema diameetri ja kõrguse korral oleks teoreetiline Vxmax tulnud ligilähedane saadud tulemusega.
52 - 42 Rf = 96 - 42 =0,185 JÄRELDUS. Töö õnnestus enam vähem hästi, ainete piir oli üpriski eristatav. Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad läbi kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest. Esimesena väljus kõrgmolekulaarne dekstraansinine, peale seda müoglobiin ja seejärel väikse Mr-ga DNP-aspartaat. Sahharoos oleks tõenäoliselt väljunud umbes ühel ajal DNP-aspartaadiga kuna mõlemad on madalmolekulaarsed. Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramiseks mõõdetud kõrguse ja diameetri leidmisel tehtud veast. Suurema diameetri ja väiksema kõrguse korral oleks teoreetiline Vxmax tulnud ligilähedane saadud tulemusega.
Järeldused · Esimesena väljus kolonnist dekstraalsinine. Selle aine osakesed on liiga suured et mahtuda selle geeli pooridesse. Dekstraalsinine on proovi kõige suurema molekulmassiga aine, seetõttu väljus dekstraalsinine kolonnist kõige kiiremini. · Teisena väljus kolonnist müoglobiin, mis osaliselt difundeerus geeli pooridesse. Müoglobiini molekulmass on väiksem kui dekstraalsinisel, kuid suurem kui DNP- aspartaadil. · Viimasena väljus DNP-aspartaat ning selle aine osakesed geeli pooridesse ei mahtunud. Selle aine molekulid on kõige väiksemad ja ka kõige väiksema molekulmassiga, mistõttu väljus see aine kolonnist viimasena. · Eelpool arvutatud Vx,max väärtust erineb katselise Vxmax väärtusest: 98 85 = 13 ml. Arvutuslikult oleks pidanud eluaati koguma 13 ml rohkem. Erinevus võib põhineda valedel kolonni mõõtmistulemustel. Võisin eksida kolinni läbimõõdu ja kõrguse mõõtmisel
R f = max V x - V xmin 45,5 - 27,5 Rf = = 0,36 77,5 - 27,5 Järeldus: Töö õnnestus enam vähem normaalselt. Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest. Esimesena väljus kõrgmolekulaarne dekstraansinine, peale seda müoglobiin ja seejärel väikse Mr- ga DNP-aspartaat. Sahharoos oleks tõenäoliselt väljunud umbes ühel ajal DNP- aspartaadiga kuna mõlemad on madalmolekulaarsed. Erinevus teoreetilise ja saadud Vxmax-i vahel võis olla tingitud kolonni mahu määramiseks mõõdetud kõrguse ja diameetri leidmisel tehtud veast.
tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl 2 Mõõtmistulemuste tabel Fraktsiooni number Elueerumismaht V (ml) Optiline tihedus (A) Ühendatud fraktsioon 25 0 1 27 0,042 2 29 0,2026 3 31 0,1868
4 0.3 0.2 0.1 0 Eluaadi maht (V,ml) Graafik 1. Kromatogramm Järeldus Kromatogrammi pealt on näha kolm tippu, mis seletab ainete kolonnist väljumise järjekorda. Esimesena väljus kõige suurema molekulmassiga aine – dekstraansinine, seejärel müoglobiin ning siis väikseima molekulmassiga aine – DNP-aspartaat. Dekstraansinise molekulid ei mahtunud kolonni täitva geeli pooridesse. Müoglobiini molekulid difuneerusid geeli pooridesse rohkem ning DNP-aspartaadi molekulid difundeerusid geeli pooridesse täielikult. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni – Vxmin = Vv = 31ml Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 39 ml
Vxmax fraktsiooni väljumiseni. Vxmin Dekstraansinise elueerumismaht on võrdne kolonni vaba mahuga, kuna tema molekulmass on 200 kDa ning ta ei mahu geeli pooridesse ja liigub pooridevahelisel alal, kuivõrd antud geeli lahutuspiirkond on .... 3000-80000 Da. Dekstraansinine väljus esimesena, kuna tema molekulaarmass on suurim ja ta ei mahtunud geeli pooridesse. DNP-aspartaat on väikseima molekulaarmassiga ning ta difundeerus täielikult pooridesse ja läbis seetõttu kolonni kõige aeglasemalt. Kuna geelkromatograafia põhimõtte on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi, siis järeldan ka, et ma ei tegelenud praktikumis mustkunstiga ning sain ootuspärased tulemused, kus kõige suurema molekulmassiga aine väljus esimesena ning kõige väiksema molekulmassiga väljus viimasena
Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud)
väljumiseni Vxmin = Vv = 22 ml.
Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud)
väljumiseni Vx = 30 ml.
Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi DNP-aspartaadi kõrgeima
kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vxmax = 56 ml.
D. Viimasena väljunud komponendi (DNP-aspartaat) elueerimismaht oli 56 ml. Arvutuslik
Vxmax = 57,6. Need arvud langevad suhteliselt kokku, järelikult on töö korrektset läbiviidud.
E. Segus sisaldunud valgu jaoks liikuvusteguri Rf väärtuse arvutamine, kasutades Rf
arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vxmax väärtust.
Rf = Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin = 0,225 - Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0...1 (0
Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Teooria Geelkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruse järgi. Lahuses sisalduvaid erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise poorse geeli erineva kiirusega. Kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis kolonnis, mis on täidetud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide mõõtmetega. Geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist, või D-galaktoosist. Kui läbi kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu siis molekulid lahutuvad vastavalt suurustele. Et segu läbi kolonni transportida ning erineva molekulmassiga ained lahutada voolutatakse seda sobiva vesilahusega ning kogutakse eluaati kindla mahuga fraktsioonid...
25 69,5 0,484 360 26 71,5 0,186 360 27 73,5 0,056 360 28 75,5 0,033 360 C. Kromatogrammilt: Komponentide elueerumisprofiilid: Dekstraansinine (: A = 0,400; eluaadi maht V = 25,5 ml Müoglobiin (: A = 3,0; eluaadi maht V = 33,5 ml DNP-aspartaat (: A = 1,364; eluaadi maht V = 65,5 ml Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, mis tõestab, et sellel on kõige suurem molekulmass. Tänu sellele ei difundeerunud ta geeli pooridesse, vaid väljus kolonnist graanulite vahelt minimaalse elueerimismahuga, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vxmin = 25,5 ml.
65 40.65 50.65 60.65 70.65 80.65 90.65 Eluaadi maht, ml Esimesena väljus dekstraansinine, mille kontsentratsioon on üsna väikene. Kuna see väljus esimesena, siis on ka tegu kõige suurema molekulmassiga ainega. Teisena väljus müoglobiin, mille kontsentratsioon on juba ligikaudu 10 korda suurem. See väljus kolonnist teisena, mis tähendab, et selle molekulmass on väiksem dekstraansinisest, aga suurem DNP-aspartaadist. Viimasena väljus DNP-aspartaat, mille kontsentratsioon on enam-vähem sarnane müoglobiinile. Viimasena väljununa on selle aine molekulmass kõige väiksem. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsioonini (kaasa arvatud on) Vxmin = Vv = 24,65 ml Eluaadi maht kuni valgu kõige kõrgema kontsentratsiooniga (kaasa arvatud) väljumiseni Vx=44,65 ml Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud kõrgeima kontsentratsiooniga (kaasa arvatud) fraktsiooni väljumiseni Vxmax= 70,65 ml
TTÜ keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetööl YKL0060 Biokeemia Laboratoorne Töö pealkiri: Ainete segu lahutamine töö nr: 2.1 geelkromatograafia meetodil Õpperühm: Töö teostaja : Kati Muldma 123907 YASB 21 Õppejõud: Töö teostatud: Protokoll esitatud: Tiina Randla 27.02.2013 12.03.13 1. Töö teoreetilised alused 1.1 Töö eesmärk Eesmärgiks oli ette antud lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmasside suuruse järgi. Seda saab läbi viia geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafiaga, mis on üks kromatograafia meetoditest. Tänu ainete erinevale molekulmassile liiguvad nad geelist läbi erineva kiirusega, kusjuures geeli poorsus peab olema selleks võimalikult ühesugune. Seda meetodit võib kasutada makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamise...
Sinised fraktsioonid mõõdetakse lainepikkusel 670nm, pruunid lainepikkusel 410nm ja kollased lainepikkusel 360nm. Koostatakse katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine (molekulmass 2 000 000 Da), mis ei läbinud geeli poore ja väljus minimaalse elueerimismahuga. Teisena väljus müoglobiin (molekulmass 17 800 Da), mis osaliselt difundeerus geeli. Viimasena väljus DNP-aspartaat (molekulmass 299 Da), millel on võrreldes teistega väga väike molekulmass ning seetõttu difundeerus täielikult geeli pooridesse. Eluaadi maht kuni deksrtaansinise kõrgeima konstentratsiooniga kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli Vxmin = 20,75 ml Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli Vx = 28,75 ml Eluaadi maht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni oli Vxmax = 57,75
2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE 2. A Kromatograafilised meetodid Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva, mida nimetatakse ka mobiilseks faasiks, ja liikumatu, mida saab nimetada ka statsionaarseks, faasi vahel. Mobiilse faasi agregaatolekust sõltuvalt eristatakse gaasi-, vedelik- ja ülekriitilise fluidumi kromatograafiat. Statsionaarse faasina võib kasutada adsorbenti, ioniiti, biospetsiifilist sorbenti, poorset geeli või kandja pooridesse seotud vedelikku. Sõltuvalt statsionaarse faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest eristatakse järgmisi kromatograafia liike: · jaotuskromatograafia, · adsorptsioonkromatograafia, · afiinsuskromatograafia, · ioonvahetuskromatograafia, · geelkromatograafia. Kromatograafiat kasutatakse lipiidi, süsivesikute, valgude, aminohappete jt biomolekulide lahutami...
Täidise kõrgus L = 33 cm Täidise diameeter d = 1,8 cm ; r = 0,9 cm Täidise kogumaht Vt = r 2 L = 0,9 2 33 = 83,98cm3 Geelmaatriksi maht Vg = k Vt = 0,1 83,98 = 8, 40cm3 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt - Vg = 83,98 - 8, 40 = 75,58cm3 Fraktsioonide üldarv V max 75,58 n= x = = 37, 78 38 2 2 Voolutuslahuse koostis 50 mMTris-HCl 150 nM NaCl pH = 7,5 Uuritava proovi koostis Dekstraansinine (sinine) Müoglobiin (pruun) DNP-aspartaat (kollane) Töö kolonniga Kõigepealt avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et voolutuslahuse nivoo oleks võrne täitegeeliga. Samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirus reguleerimisklambri abil õigeks (soovitav voolukiirus 0,7-1,0 ml/min, millele vastab 1 tilk nelja sekundi jooksul). Voolutuslahus kogutakse väiksesse keeduklaasi ja visatakse pärast minema. Seejärel lisatakse kolonni uuritav proov. Pipetti võetakse 0,5 ml uuritavat proovi (koostis kirjas eespool)
Reguleerida tuli ka voolukiirus 0,5-0,8 ml/min. Hiljem, kui siniselt värvunud molekulid olid geelist läbi tulnud, võis kiirust lisada. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 0,5ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. 4. Lisasin puhverlahust, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused: Geelisamba kõrgus: 31cm
TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Õppeaine YKL0063 Biokeemia PRAKTIKUM: Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Üliõpilane: Juhendaja: Kood: Esitatud: Sooritatud: 2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Teooria Geelkromatograafia põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende erinevate molekulmasside järgi. Lahuses sisalduvad ained liiguvad läbi geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. Proov viiakse läbi kolonni vesilahuse abil. Geelkromatograafia protsess toimub kolonnis, mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromo...
graanulitevahelise mahuga. Ta väljus esimesena, sest tema molekulid on liiga suured ning ei mahu geeli pooridesse, tema molekulmass on suurim. Eluaadimaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooga fraktsiooni väljumiseni on Vx;min=Vv=26ml(ühendatud fraktsioon)+6ml=32ml. Järgmisena väljus kolonnist müoglobiin (teine kõver kromatogrammil) Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx=32+24=56ml. Kolmandana väljus DNP-aspartaat (kolmas kõver) ning see on kõige väiksema molekulmassiga aine, ta difundeerus kõige rohkem geeli pooridesse, väljus maksimaalse elueerimismahuga. Eluaadi maht DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni:Vx;max= 56+34=90ml. D. Viimasena väljunud komponendi elueerimismahtu võrreldakse arvutusliku Vx;max väärtusega. Arvutuslikult sain, et Vx;max=95.4ml. Katse tulemusel sain aga 90 ml. On näha, et need on natukene erinevad
Ainete segu lahutamine geelkromotograafia meetodil Teooria Geelkromotograafia e geelfiltratsioonkromotograafia on üks kromotokraafia meetotitest, mille mõhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmassi suuruste järgi. Geelkromotograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. Geelkromotograafias viiakse protsess läbi kinnistes süsteemis kolonnis. Kolonn on täidetud pundunud geeligraanulitega. Kolonni poorid on samas suurjusjärgus sisuldavate makromolekulide dimensioonidega. Geelkromotograafias kasutavad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Geelkromotograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht ( V v) Graanulise vedeliku maht ( Vs ) Gee...
Oluline oli mitte kolonni lasta kuivaks joosta, sest muidu tungib õhk geelikihti. Kasutatud kolonnil oli automaatselt reguleeritud kiirus. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 1ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. 4. Kogusin eelfraktsiooni mõõtkolbi, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogutud eelfraktsiooni mahu mõõtsin mõõtsilindri abil. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga.
annaabi.ee 
