Valkude ja süsivesikute reaktsioonid. (0)

16
Biokeeemia laboritöö No 1
Valkude ja süsivesikute reaktsioonid.
Protokool on parandanud. Kõik parandused on tehtud punase värvusega!
Reaktsioonivõrrandid on võtnud laboratoorsete tööde juhendist , sest ei oska neid ise Wordis kirjutada. https://v2.ttu.ee/public/b/bioorgaanilise-keemia-oppetool/YKL3311_Biokeemia/Praktikum/BK_praktikum.pdf
Õppejõu eelnevad märkused: „Valkude ja süsivesikute reaktsioonid. Vaadake oma tulemuste analüüs läbi, kohati ei saa aru, mida öelda tahate. Puudu on reaktsioonivõrrandid ja reaktsioonide kemismi võiks üldse põhjalikumalt kirjeldada. 
Kas osasooni pildid on Teie omalooming? Meenutavad kahtlaselt juhendi pilte. Siis tuleks sellele ka viidata, võõraste sulgedega ehtimine on plagiaat ja pole kooskõlas akadeemilise aukoodeksiga.
Kus on tärkliseterade pildid?”
Õpperühm: YAGB21
Töö teostaja : Alexander Kirichuk 123695
Õppejõud: Tiina Randla


Esimene osa: Valkude reaktsioonid.
Töö teoreetilised alused:

• Valgud – polüpeptiidid, milles aminohaped on seotud amiidsidemete abil.
  
• Valkude koostises on 20 üldlevinud aminohappet (protogeensed).
  
• Valku struktuurid :
  

1) Primaarne
2) sekundaarne
3) tertsiaarne
4) kvaternaarne

• Denaturatsioon – valgu unikaalse ruumilise struktuuri lagunemine .
  
• Valkude detekteerimise meetodeid :
  

• Värvusreaktsioonid
  
• Väljasadestamine
  
• Väljasoolastamine
  

• Kvalitatiivsed reaktsioonid:
  

• Universaalsed – on omased kõikidele valkudele
  
• Kvalitatiivsed – on iseloomulikud ainult teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele.
  

Biureedireaktsioon .
Teoreetilised alused:

• Ühendid mis sisaldavad 2 või rohkem peptiidsidet , moodustavad alulises keskkonnas Cu2+ ioonidegha violetse kompleksi.
  
• Leeliselises keskkonnas moodustavad Cu2+ ioonid :
  

• Valgumolekulidega sinikasvioletse biuretkompleksi
  
• Lühikese ahelaga peptiididega roosa värvusega biureetkompleksi.
  

Töö käik:

• Katseklaasi valatakse 1ml munavalgu lahust
  
• + 1ml 10%-list NaOH + 1%-list CuSO4
  
• Vesivannis soojendamine
  
• jälgime
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Reaktsioonisegu muutus violetseks, järelikult töö on teostatud õnnelikult ja reaktsiooni
käigus oli moodustanud Biureeti Cu2+ kompleksid , mis on värvuse muutmise põhjuseks.
Järelikult uuritav lahus sisaldab valku.
1.1.2 Ksantroproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon )
Teoreetilised alused:

• Mulderi reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu valgus (teiste sõnadega detekteerib neid.
  
• HNO3 denatureerib valk pöördumatu
  
• Soojendamisel toimub aromaatse tuuma nitreerimine
  
• Moodustunud ühend on kollase värvusega ja käitub indikaatorina (omandab leeliselises keskkonnas oranzi värvuse)
  

Töö käik:

• Katseklaasi valatakse 1ml munavalgu lahust
  
• + 5-6 tilka konts. HNO3
  
• Segu loksutakse ja soojendakse
  
• Kui tekkinud valge sade värvub kollaseks, jahutame
  
• + NH4OH kuni ammoniaagi lõhna ilmumiseni
  
• Loksutakse
  
• Kirjeldame muutusi
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
HNO3 lisamisel tekkis sade.(valk denatureerib) Soojendamisel värv muutus kollaseks. NH4OH lisamise tulemuseks värv muutus oranziks, järelikult munavalk sisaldab aromaatse tuuma sisaldavad valgud (Tyr, Trp, Phe), mis nitreeritakse HNO3-ga ja teenivad indikatorina muutudes oranziks leeliselises keskonnas. töö on teostatud õigesti. Lisaks sellele nüüd tean, et HNO3 võib denatureerida valku ja nitreerima aromaatse tuuma.
1.1.3 Milloni reaktsioon
Teoreetilised alused:

• Läbiviimiseks kasutatakse Milloni reaktiivi.
  
• Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega valkude puhul Tyr-radikaalid.
  
• Suurem osa valkudest annab positiivset reaktsiooni
  
• Valgu lahus muutub roosaks kuni tumepunaseks.
  

Töö käik:

• Kaks katseklaasi
  
• Ühte valatakse 1ml munavalgu lahust, teise 1ml zelatiini lahust
  
• Mõlemad + 5-6 tilka milloni reaktiivi
  
• Segu soojendatakse 40-50o C-ni ja jälgitakse muudatusi
  
• Järeldused
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Zelatiin muutus heleroosaks, aga munavalk muutus roosaks ja tekkis sade, järelikult zelatiinil on vähem Tyr-radikaalit kui munavalgul, siis munavalgu reaktsioonil värv on tugevam.
1.1.4 Sulfhüdrüüli e. Tioolireaktsioon.
Teoreetilised alused:

• Positiivne tioolireaktsioon näitab Cys esinemist valgus.
  
• Cys radikaal sisaldab aga (SH) grupi, mis allub hõlpsasti leeliselise hüdrolüüsile, ja annab sulfiidioone
  
• Pb2+ - ioonide juuresolekul need moodustavad tumepruuni PbS sademe.
  
• Katse teostatakse Pb( CH3COO )2.
  
• Moodustab alulises keskonnas Na2S .
  
• Na2S annab valgust vabanenud PbS-ga.
  

Töö käik:

• 2ml Pb(CH3COO)2 0,5% - line lahus + 10% NaOH kuni Pb(OH)2 kaob ja moodustub Na2PbO2
  
• + 1ml munavalgu lahust
  
• Loksutakse, soojendatakse
  
• Pruuni saade moodustumise hakkamisel asetatakse katseklaasi statiivi
  
• Jätkub formeerimine
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Kuumutamisel lahus muutus helepruuniseks pärast muutus tumepruuniseks PbS aeglaselt välja sadeneb ja me näeme kuidas lahus muutub tumedaks.Siis munavalgus esineb Cys aminohappe.
1.1.5 Valkude sadestamine triklooräädikhappega.
Teoreetilised alused:

• TKÄ on valke denatureeriv ja lahusest väljasadestav reagent, kuid ei sadesta peptiide, mille molekulmass on alla 10000.
  
• Siis TKÄ kasutades eraldame valgud madalamolekulaarsetest lämmastikuuühenditest.
  

Töö käik:

• Katseklaasi valatakse 1ml munavalgu lahust ja lisatakse mõni tilk CCl3COOH lahust.
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Me näeme valge sade. Võin oletama, et see on denatureerunud valk, mille molekulmass on suurem kui 10000, siis lahuses on jäänud ka väikesed denatureerimata valku molekulid. Järelikult TKÄ denatureerib valgu suure molekulaarmassiga, kuid ei sadesta väikese molekulaarmassiga(alla 10000)
1.1.6 Valkude väljasoolastamine.
Teoreetilised alused:

• Neutraalsete soolade kõrged kontentratsioonid denatureerivad (pöörduvalt).
  
• Väljasadenemise protsessi mõjutavad valgu hüdrofiilsus, laeng, molekulmas jne.
  

Töö käik:

• 2ml munavalgu + 2ml küllastanud (NH4) 2SO4
  
• 5 minutiks jäetakse seisma
  
• Filtritakse
  
• Filtraat + (NH4)2SO4 ( kristall )
  
• Jälgitakse albumiide sademe modustumist.
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Poolküllastanud lahuses (NH4)2SO4 sadenevad globuliinid . Need on jäänud filtris . Albumiinid aga ei sadene poolküllastunud lahuses. Nende sadenemiseks on vajalik küllastunud lahus. (NH4)SO4 lisamisel küllastamiseni jälgime albumiinite sade tekkimist.
1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahuse sõltuvus pH- st.
Teoreetilised alused:

• Kõik valgud denaturerivad kõrgel temperatuuril.
  
• Denatureerimise temperatuur sõltub valguse omadustest ja kekskonnast.
  
• Denatureerinud valk tavaliselt väljasadeneb.
  
• Valgu isoelekrilisest täpist tunduvalt erineva pH puhul võib denatureerunud valk ka lajusesse jääda.
  

Töö käik:

• Kahte katseklaasi valatakse 2ml munavalgu lahust.
  
• I katseklaas + konts. Äädikhappe
  
• Lahused kuumutatakse keemiseni.
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Lahus I-katseklaasis (kus oli äädikhape) jäi muutumata, aga teises tekkis sade. Kuid teame, et mõlemates lahuses oli toimunud denatureerimine. Siis võime oletama, et madala pH tõttu denatureerinud valk jäi lahuses.
1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega .
Teoreetilised alused:

• Veega segunevad solvendid põhjustavad valkude dehüdreerimist ja tekkib sade.
  
• Sadesti kontsentratsiooni vähenemisel lahustub tekkinud sade uuesti.
  

Töö käik:

• Katseklaasi valatakse 2ml munavalgu
  
• + orgaaniline solvent
  
• + vesi (kuni sademe lahustumiseni)
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Minu juhul tekkinud sade ei lahustunud vesi lisamisel. Võimalikult oli lisanud liiga palju solvendi, mis tekitab pöördumatu denaturatsiooni .
Teine osa: Süsivesikute reaktsioonid.
Teoreetilised alused:

• Vastavalt struktuurile jaotatakse süsivesikuid mono -, oligo- ja polüsahhariidideks.
  
• Vastvalt vaba aldehüüdrühma esinemisele molekulis jaotakse suhkrud redutseerivateks ja mitteredutseerivateks.
  
• Paljud süsivesikud määramiseks kasutatvad reaktsioonid baseeruvasd nende redutseerimisvõimel.
  
• Leeliselis keskkonnas redutseeruvad suhkrud metallide ioone.
  
• Suhkrute oksüdatsioon ilma molekuli destruktsioonita toimub neutraalses või happelises keskkonnas produktideks on happed.
  
• Teine osa meetoditest põhineb heterotsükliliste aldehüüdide moodustumisel süsivesikute kuumutamisel.
  

1.2.1 Molischi test
Teoreetilised alused:

• Molischi test on süsivesikute kvalitatiivse analüüsi põhitest
  
• Kui süsivesikud on olemas lahus, tekib nende segus α-naftooliga kontsentreeritud väävelhappe lisamisel piirpinnale purpurne vahekiht .
  

Töö käik:

• Katseklaasidesse valatakse 2ml uuritava süsivesiku.
  
• + 2ml Molischi reaktiivi, segatakse
  
• + 1ml H2SO4
  

NB! Hape peab voolama mööda katseklaasi külge selle põhja uuritava lahuse alla, kusjuures happe ja proovi segunemist tuleb hoolikalt vältida!
Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Reaktsioonisegu muutus roosaks. See tähendab, et lahuses oli süsivesikud, mis reageerisid Molchi reaktiiviga, mille tulemusena tekkis purpurne kondensatsiooni produkt . Molchi test aitab detekteerima süsivesikud lahustes.
1.2.2 Osasoonide saamine.
Teoreetilised alused:

• Osasoonid – redutseeriva suhkru ja kahe molekuli fenüülhüdrasiini liitumise produkt.
  
• Kristallide kuju ja sulamistemperatuur on lähtesuhkrule iseloomulikud. Nende järgi võib suhkru identifitseerida.
  
• 
  

Töö käik:

• Kahte klaasi valatakse 2ml erineva taandava suhkru (minu juhul glükoos ja laktoos ) lahust.
  
• + 0,1 g fenüülhüdrasiini + 0,2 g naatriumatsetaat.
  
• Loksutakse
  
• Hoitakse 40 minutit keeval veevannil.
  
• Vaadeldakse mikroskoobis tekkinud kristalle.
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
40 minutit kuumutamise jooksul tekkisid osasoonid. Olen käsitlenud ja pildistanud neid protokoli.
Osasoonide pildid on võtnud juhendist. https://v2.ttu.ee/public/b/bioorgaanilise-keemia-oppetool/YKL3311_Biokeemia/Praktikum/BK_praktikum.pdf
1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon
Teoreetilised alused:

• Taandavates suhkrutes sisalduv aldehüüdrühm redutseerib mitmete metallide sooli.
  
• Hõbeda ammoniakaalsest lahusest sadestub metall klaasi pinnale peeglina.
  

Töö käik:

• Hoolikalt pestud katseklaasi valame 1ml 1% HNO3
  
• +0,5ml konts NH4OH + 1ml glükoosi lahus
  
• Segu soojendatakse
  
• Hõbe peab sadestama seintele peeglina.
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Reaktsiooni tulemusena tekkis seintel hõbekiht. Hõbe sadestus ammoniakaalse lahusese aldehüüdrühmiga reageerimise tulemuseks.
1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega.
Teoreetilised alused:

• Fehlingi reaktiiv – taandavate suhkrute määramiseks kasutatav reaktiiv. (Fehlingi-I + Fehlingi-II)
  
• Reaktsiooni tulemuseks tekkib punane sade CU2O
  
• NB! Saharoos ei reageeri Fehlingi reaktiiviga, kuid reageeruvad tema hüdrolüüsi produktid.
  
• Inversuhkur – glükoosi ja fruktoosi ekvimolaarne segu
  
• Inversioon – hüdrolüüsi protsess
  
• 
  
• Hüdrolüüs kiirendatakse happega .
  

Töö käik:

• Kahte katseklaasi valatakse 1 ml sahharoosi lahust
  
• I katseklaas + 1 tilk konts. HCl
  
• Kuumutatakse 10 minutit 80-85o C veevanns
  
• Mõlemad + 1ml fehlingi I ja II lahust.
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Ühes katseklaasis tekkis punane sade (Cu2O) , teises aga mitte. Esimeses oli HCl lahus , mis kiirendus suhkru hüdrolüüsi, mille tulemusena tekkisid fruktoos ja glükoos(taandavad suhkrus). Teisel hüdrolüüsi on väga aeglane, sest aga saharoos ei reageeri Fehlingi reaktiiviga, sest saharoos ei ole taandav suhkur ning ei reageeri Fehlingi reaktiiviga.
1.2.5 Barfoed` reaktsioon.
Teoreetilised alused:

• Suhkrute reaktsion Barfoedi reaktiivivga võimaldab eristada taandavaid mono- ja oligosahhariide.
  
• Monosahhariidide reaktsioonil tekib katseklaasi põhja tumepunane CuO2 sade.
  
• 
  
• Happelises keskkonnas taandavad vaske üksnes monosahhariidid .
  

Töö käik:

• Võetakse 2 katseklaasi
  
• Ühele lisame 1ml monosahhariidi lahust (glükoos)
  
• Teisele lisame taandavat disahhariid . (laktoos)
  
• Mõlemad + 3ml Barfoed reaktiiv
  
• Segatakse ja kuumutatakse 5-10 minutit.
  
• Jälgitakse sademe moodustumist.
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:

• laktoosi juhul sade ei teki
  
• glükoosiga katseklaasis tekkis sade.
  

Järelikult taandavad monosahariidid ja oligosahariidid reageeruvad Cu2+ ioonidega, mille tulemusena tekkib punane sade (Cu2O), kuid happelises keskkonnas reageeruvad ainult monosahariidid, mis annab võimalust eristada taandavaid monosahariide oligosahariididest
1.2.6 Selivanoffi reaktiiv.
Teoreetilised alused:

• Suhkrute kuumutamisel moodustub pentoosidest heterotsükliline aldehüüd furfurool,eksoosidest aga hüdroksümetüülfurfurool
  
• Tekkivad ühendid reageerivad fenoolidega ja annavad värvilise produkti
  
• Üks selles protsessis kasutavaid reaktiive on Selivanoffi reaktiiv.
  
• Ketoosidega reaktsioon toimub kiiremini kui aldoosidega.
  

Töö käik:

• Ühte katseklaasi valatakse 1ml fruktoosi lahust, teisse aga sama hulk glükoosi lahust .
  
• + 2-3 ml Selivanoffi reaktiivi.
  
• Soojendatakse 5 minutit veevannil.
  
• Jälgitakse.
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Glüloosilahus muutusi ei toimu, aga fruktoosi lahus muutus roosaks, mis näitab et reaktsioon toimub aldoosidega aeglasem kui aldoosidega.
1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga .
Teoreetilised alused:

• Tärklis moodustub joodiga lillakassiniseid komplekse (on tingitud polüsahhariidahelate keerdumisest joodi molekulide ümber).
  
• Kõrgemal temperatuuril värvus kaob, sest kompleksid lagunevad.
  
• 
  
• Pilton võtnud biokeemia loengu konspektist no 11... https://v2.ttu.ee/public/b/bioorgaanilise-keemia-oppetool/YKL3311_Biokeemia/Loeng/BK_11_Sysivesikud_ja_rakukest.pdf
  

Töö käik:

• Katseklaasi valatakse 4-5 ml tärkliselahust.
  
• + 1 tilk joodi.
  
• Kuumutatakse keemiseni
  
• Jahutatakse.
  

Tulemuste analüüs ja kokkuvõte:
Joodi lisamisel lahus muutus siniseks . Kuid kuuutamisel ta muutus tagasi värvusetuks ( kompleksid lagunesid). Jahutamisel lahus muutus siniseks( siis reaktsioon on pöördumav ja lahuses tekkisisd veel kord kompleksid joodiga).