Biokeemia protokoll (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemiainstituut
Biorgaanilise keemia õppetool
Protokoll N.1
Laboratoorne töö N.1
Ainete kvalitatiivsed reaktsioonid
Valkude reaktsioonid
Süsivesinikute reaktsioonid
Valkude reaktsioonid.
Valgud on polüpeptiidid, mis koosnevad omavahel peptiidsidemega seotud aminohapetest. Valkudes sisalduvaid aminohappeid on 20 ning nad erinevad üksteisest radikaaldie struktuuri poolest. Valkude primaarne struktuur iseloomustab aminohapete valikulist järjekorda, sekundaarne struktuur polüpeptiidahela üksikute lõikude korda ja tertsiaarne struktuur kogu valgumolekuli ruumilisust. Kui molekul koosneb enam kui ühest polupeptiidahelast moodustuvad oligomeersed valgud, mis omavad ka kvaternaarset struktuuri. Ruumilised struktuurid on fikseeritud nõrkade keemiliste sidemete ja vastasmõjudega. Kui valgu ruumilises struktuuris grupeeruvad ümber ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed, aga säilivad aminohappeid ühendavad peptiidsidemed, siis sellist lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks. Taastumine on reanturatsioon.
Valkude kindlakstegemiseks lahustes või bioloogilistes vedelikes ja ka nende aminohappelise koostise iseloomustamiseks kasutatakse värvusereaktsioone, denaturatsiooni protsessi uurimiseks, valkude eraldamiseks madalama molekulmassiga peptiididest ning erinevate valgusfraktsioonide lahustamiseks kasutatakse mitmeid sadestamismeetodeid. Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi: Universaalsed ehk üldreaktsioonid, mis on omased kõikidele valkudele ja spetsiifilised ehk erireaktsioonid , mis on iseloomulikud ainult teatud aminohapetele valgu molekulis või vastavas lahuses.

Buireedireaktsioon
Biureedireaktsiooni annavad kõik ained, mis sisaldavad vähemalt kahte peptiidsidet. Leeliselises kekskonnas annab valk vask(II)ioonidega sinakasvioletse värvuse, peptiidid aga roosa värvusega biureet-kompleksi, mis moodustub vase ioonide seostumisel peptiidsidemete koostises oleva hapniku aatomitega. Värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses.
Töö käik: Katseklaasi valame 1ml munavalgu lahust. Lisame 1ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust, loksutame, mille pärast lahus värvus violetseks.
Järeldus: Lahus andis violetse värvuse, sest meil on leeliseline keskkond, mida põhjustas NaOH lisamine lahusele. Pärast lisamist CuSO4, vaskioonid (Cu2+) seostuvad peptiidsideme koostises olevate hapniku aatomitega, andes meile violetse buireetkompleksi. Kõik see tähendab, et lahuses on peptiidsided ja meil on just munavalk .

Mulderi reaktsioon .
Reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu. Konts. HNO3 lisamisel sadestub valk ja soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine.
Töö käik: Katseklaasi valame 1 ml munavalgulahust ja lisame 6 tilka kontsentreeritud HNO3. Loksutame ja soojendame, mille pärast valge sade värvus kollaseks. Seejärel jahutame segu ja lisame NH4OH lahust ja loksutame. Lahus värvus oranziks.
Järeldus: Kui me soojendame meie segu, toimub aromaatsete tuumade nitreerimine ja moodustub nitrofenooli tüüpi ühend, mille värvus on kollane. Kui me lisame NH4OH lahust, nitrofenool käitub leeliselises keskkonnas kui hape ja lahus värvub oranziks.

Milloni reaktsioon
Kasutatakse elavhõbe(II) nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga ehk Milloni reaktiivi. Milloni reaktiiviga reageerivad aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped .
Töö käik: Võtame 2 katseklaasi, ühte valame 1ml munavalgu lahust, teise 1ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisame 6 tilka Milloni reaktiivi. Munavalgu lahuses moodustus valge sade. Mõlemaid katseklaasi soojendame. Munavalgu lahus värvus roosa-punaseks, aga zelatiini lahus jäi muutumatuks.
Järeldus: Munavalk andis positiivse Milloni reaktsiooni, mis on seotud sellega, et munavalgu lahus sisaldab aromaatsest tuuma sisaldavat aminohapet (Tyr, mis esineb enamiku valkude koostises). Aga zelatiin jäi muutumatuks, mis on seotud sellega, et zelatiin ei sisalda aromaatset tuuma omavaid aminohappeid.

Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
Sulfhüdrüülrühmad valkudes ja aminohapetesalluvad hõlpsasti leeliselisele hüdrolüüsile ja annavad sulfiidioonne. Pb2+ juuresolekul tekib mustjas ülipeen pliisulfiid sade.
Töö käik: 2ml Pb( CH3COO )2 0,5%-lisele lahusele lisame tilgakaupa 10%-list NaOH lahust kuni tekkiv Pb(OH)2 sade kaob. Lisame katseklaasi 1ml munavalgu lahust, loksutame ja soojendame mõne minuti vältel. Lahus värvus pruuniks . Seejärel asetame katseklaasi statiivi. Peab formeerima sade, aga sade (must) oli väga väike hulk.
Järeldus: Meil on positiivne sulfhüdrüülreaktsioon, mis tähendab, et meie valgus on tsüsteiin (Cys). Pruun värvus on seotud sellega, et sulfiidioonid (tekkisid leeliselise hüdrolüüsi tõttu) reageerisid Pb2+ ioonidega.

Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhappe on laialdaselt levinud valke denatureeriv ja sadestav reagent , kuid ei sadesta valgu hüdrolüüsi produkte, mille molekulmass on alla 10000.
Töö käik: Katseklaasi valame 1ml munavalgu lahust ja lisame mõni tilk CCl3COOH lahust. Loksutame, mille pärast tekkis valge sade.
Järeldus: Valgu sade tekkis, sest valk denatureeris. Toimus valgu eraldamine madalmolekulaarsetest lämmastikühenditest. Kõik see tähendab, et valku molekulmass, mis me kasutasime katses, on üle 10000.

Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Neutraalsete soolade suured sisaldused valgu lahuses põhjustavad valkude denaturatsiooni ja lahusest väljasadenemist, mida mõjutavad valgu mitmesugused tegurid( nt hüdrofiilsus, laeng jne.).
Töö käik: 2ml munavalgu lahusele lisame 2ml (NH4) 2SO4 küllastunud lahust, loksutame ja jääme 5 minutiks seisma. Tekkis globuliinide sade. Filtreerime sade filterpaberiga. Saadud filtraadile lisame kristelset (NH4)2SO4 kuni kontsentratsiooni saavutamiseni. (lisame väikeste portsjonitena soola ja loksutame katseklaasi hoolikalt. Toimingut korrame seni, kuni soola kristallid enam ei lahustu – maksimaalse kontsentratsioonini(küllastunud lahus). Moodustus albumiinide sade. Võrreldes juhtus, et globuliinide sade on rohkem, kui albumiinide sade.
Järeldus: Kuna valkude sadestamist sooladega mõjutavad erinevad tegurid sadestusid globuliinid poolküllastunud lahuses, albumiinid sama soola küllastunud lahuses.

Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril ja vastav temperatuur oleneb valgu loomusest ja keskkonna koostisest. Tavaliselt kaasneb valgu väljasadestumine.
Tavaliselt kaasneb denatureerumisega valgu väljasadestumine lahusest.
Töö käik: Kahte katseklaasi valame 2ml munavalgu lahust. Ühte katseklaasi lisame 1ml konts. äädikhapet. Mõlemaid katseklaase kuumutame keeval vesivannil . Lahus, kus oli ainilt munavalk, värvus valgeks (hägune), aga lahusega, kus oli munavalk ja äädikhape, mittemidagi ei juhtu.
Järeldus: Valku denatureerimine sõltub temperatuurist ja pH-st. Kaitses me näeme, et happelises keskkonnas (pH