1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. Mille poolest erineb automaatsekveneerimine klassikalisest manuaalsest sekveneerimisest? Maanualne sekveneerimine seisneb selles, et igasse katseklaasi lisati
5. Valkude bioloogiliste funktsioonide loetelu, näiteid vastava funktsiooniga valkudest. Katalüütiline- Ribonukleaas Regulatoorne- Insuliin Transport- Hemoglobiin Struktuurne- Kollageen, alfa-keratiin Reserv- Ovalbumiin, Kaseiin Kontraktsioon- Aktiin, Müosiin Kaitse- Immunoglobuliinid Adaptor e. Toes- AKAP-valgud Eksootilised funktsioonid- antifriisvalgud kalades 6. Valkude analüüsi meetodid. Valkude aminohappelise järjestuse määramiseks kasutatava sekveneerimise strateegia ja etapid. Slaidid 22-31. 7. Peptiidide laboratoorne süntees tahkel kandjal põhimõte. Sünteesitava polüpeptiidi C-terminus on kovalentselt seaotud lahustumatule vaigule. Liidetava aminohappe aminorühm kaitstakse blokeeriva rühmaga, mis pärast aminohappejäägi liitmist kasvavale peptiidahelale eemaldatakse. Liidetava aminohappe karboksüülrühm aktiveeritakse karbodiimiidiga. Iga aminohappejäägi lisamise järel tahke faas filtritakse välja.
komponendi, molekulaarse funktsiooni nomenklatuuri abil liigist sõltumatul moel. Go projekti iseloomustab ontoloogiate arendus ning hooldus ja tarkvaraarendus (võimaldab ontoloogiate loomist, hooldamist ja kasutamist) 27. Mis on järjestamine? 4:3. DNA sekveneerimine e. järjendamine tähendab protsessi, mille käigus selgitatakse DNA nukleotiidne järjestus. 28. Milliseid molekule saab sekveneerida? DNA, RNA, valgud. 29. Kirjeldage tähtsamaid sekveneerimise ajalooga seotud verstaposte. Mis oli nende avastuste ja tehnoloogiate tähtsus? 4:6- 10, 4:14. 1951. aastal tegi Frederick Sanger kindlaks veise insuliini aminohappelise järjestuse. Esimene sekveneeritud molekul oli seega valk! 1953. aastal avaldasid James D. Watson ja Francis Crick artikli DNA kaksikheeliksmudeli kohta. Sek. meetodi looja oli 1977.aastal Frederick Sanger 1990. aastal alustati projektiga sekveneerimaks inimese genoomi
Inimese genoomi projekt (ajalugu, eesmärgid, ELSI, strateegiad). 1956 a. esimene inimgenoomi füüsikaline kaart 1977 a.Sanger: dideoksü sekveneerimise metoodika 1980 a. Botstein: geneetiline kaart RFLP-de alusel 1981 a. Sanger: mitokondriaalse genoomi järjestus 1987 a. USA DoE initsiatiiv inimgenoomi uurimiseks 1988 a. USA NIH loob National Center of Human Genome Research, paralleelselt luuakse HUGO 1990 a. algab HGP 1992 a. Weissenbach: esimene mikrosatelliitidel põhinev geenide aheldatuse kaart 1995 a. Lander: esimene STS põhinev aheldatuse kaart 1999 a. Sanger Center: esimene inimkromosoomi (22) täielik järjestus 2001 a
järjeldused vääraks. Genoomi funktsionaalsete elementide ennustamine, kodeerivate geenide ülesleidmine, evolutsioonilise päritolu selgitamine kõiki neid protseduure mõjutab oluliselt koostu kvaliteet. Koostu kvaliteedi probleemi muudab komplekssemaks järjest uuemate sekveneerimistehnoloogiate väljatöötamine. Uued sisendandmed, mis söödetakse programmidele, on teistsuguste iseärasuste ja vigadeprofiiliga kui sekveneerimise teerajajaks osutunud Sangeri meetodi lugemid (read). Seega peavad tarkvarade loojad pidevalt olema arengutega kursis ja kohastuma nii, et loodavad programmid suudaksid andmeid õigesti töödelda. Kuna sisendandmed on kiires muutumises, on keeruliseks osutunud ka seniste koostute kvaliteedi hindamine. Kui genoom saab assembleeritud ehk taas kokkupandud, mille alusel võivad teadlased väita, et tegemist ongi absoluutselt õige koostuga?
41. Ligikaudu mitu erinevat valku on inimeses? Inimeses on ligikaudu 50 000 erinevat valku. 42. Teatud juhtudel võib valkudes esineda fosforüleeritud seriinijääk. Kas seriinijäägi fosforüleerimine toimub enne või pärast seriini lülitamist polüpeptiidahelasse? Seriinijäägi fosforüleerimine toimub pärast seriini lülitamist polüpeptiidahelasse. Seriini fosforüleerimine ATP poolt kas aktiveerib või passiveerib valku. 43. Millist polümeeri struktuuri tasandit määratakse sekveneerimise abil? Sekveneerimise abil määratakse primaarstruktuuri. 44. Kas peptiidsideme ümber on võimalik polüpeptiidahela vaba pöörlemine? Põhjendage. Ei ole, sest peptiidsidemel on suuresti kaksiksideme iseloom. 45. Joonistage toodud aminohapete baasil dipeptiid transkonfiguratsioonis. (võivad olla erinevad aminohapped). 46. Näidake (noolega) milliste sidemete ümber on võimalik polüpeptiidahela vaba pöörlemine.
modulaarne bioloogia: Genoomide tasemel - Molekulaarne fülogenees, võrdlev genoomika, käitumise genoomika, strukturaalne ning funktsionaalne genoomika ja proteoomika jne; Funktsionaalne genoomika oleks DNA järjestuses leiduva informatsiooni taandamine funktsioonile ehk struktuurilt funktsioonini; Metodoloogiliseks aluseks geneetilised meetodid; Genoom on erinevate DNA (RNA) molekulide (nukleaarse, mitokondriaalse, plastiidse, plasmiidse jne.) summa mingi kindla liigi rakku(de)s. Genoomide sekveneerimise ning bioinformaatika tulemused: Aheldatusgruppide leidmine, Genoomide ehituse võrdlused, Genoomse DNA, EST-de ja cDNA-de kombineerimine > valkude iseloomustamine, Geeniregulatsiooni alused, Evolutsiooni, ligitekke ja fülogeneesi alused, Liigisiseste genoomsete variatsioonide ja neist tulenevate erinevate fenotüüpide tuvastamine (HapMap). Viie peamise metodoloogia areng genoomikas: 1956 "kromosomoloogia", 1966 somaatiliste
Erinevatel restriktaasidel on erinevaid soolakontsentratsioone vaja. Samuti tuleks jälgida mis temperatuuri juures need restriktaasid töötavad. Enamusele sobib temperatuus 37 kraadi. Kontrollrestriktsiooni geelipildi analüüs. Minu restriktsioon õnnestus, kuna näeme, et eraldunud bänd on kuskil 600- 700bp, mis peakski nii olema. Rajal ei ole näha teisi segavaid bände ehk restriktaas ei ole kuskilt mujalt lõiganud. Praktiline töö nr.9: Bioinformaatiline sekveneerimise tulemuste analüüs Eesmärk: Kloneeritud plasmiidi sekventsi analüüs ja ümberkloneerimise plaani koostamine Töö käik ja analüüs: 14 Mina valisin DST_T7_E10.ab1 failist sekventsi Sekventsi kvaliteedi hinnang: Väga hea kvaliteet, usaldusväärsuse vahemik on suur ja tausmüra on väga vähe. Usaldusväärsuse vahemik : 23-820 Blast ja selle tulemused: 1. Identities 632/632 ehk kõik nukleotiidid klapivad ja ei ole toimunud mutatsioone
DNA. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Rekombinantsed valgud on meile väga praktilised, kuna saame neist toota erinevaid ravimeid nt. insuliini. Kasutatakse veel toidutööstuses ensüümid (piim, juust), keskkonnakaitses (toksiliste jääkide likvideerimine bakterite abil). Kloonitud geenid on kasulikud tegemaks uuritavast geenist kergesti hallatavaid koopiaid ja tootmaks selle põhjal vajaminevat valku. Sangeri sekveneerimise põhimõte. Kasutatakse didesoksüribonukleotiide, mis erinevad desoksüribonukleotiididest selle poolest, et suhkrujäägis ei ole 3’ otsas hüdroksüülrühma, mille tõttu ei saa ahel edasi minna, vaid süntees jääb selle koha peal pidama. Sekveneeritav DNA pannakse reaktsioonianumasse tavaliste desoksüribonukleotiididega ja sünteesitud didesoksüribonukleotiididega. Reaktsioonid viiakse läbi iga lämmastikalust sisaldava
kasutada restriktaasi, mis hüdrolüüsib C-G järjestusi (näiteks Cfr42I (SacII), CCGC'GG; NotI GC'GGCCGC;). Need restriktaasid on reeglina tundlikud C metülatsioonile C mpG järjestuses, võimaldades restrikteerida seega aktiivseid geene (inaktiivsed võivad olla metüleeritud). Seega on antud töö eesmärgiks kloneerida CpG saarekestel paiknevaid geene, täpsemalt geenide regulaatoralasid ja saadud järjestuste kuuluvus teha kindlaks DNA järjestuste määramise (sekveneerimise) abil. Saadud töö tulemused võivad leida kasutust molekulaargeneetika laboratooriumi teaduslikus uurimistöös. Käesolevas töös saab üliõpilane ettekujutuse genoomse DNA restriktsioonist, kloneermisest, raamatukogu-valmistamisest, PCR reaktsioonist, DNA sekveneerimisest, jt. molekulaarbioloogia põhilistest töömeetoditest. Iga üliõpilane esitab pärast töö teostamist protokolli (kas paberil või elektroonselt), milles toob ära põhilised tulemused ja lisaülesannete vastused
kasutusalasid tänapäeval. Milline on üldine empiiriline tähelepanek, mis lubab HW-d kasutada suurte populatsioonide (nagu inimene) struktuuri uurimisel? Mis võiks selle põhjus olla? Kasutusalad tänapäeval: Tohutute andmehulkade juures mida täna produtseeritaks on HWE üks kvaliteedi kontrolli etappe. Kui ikka mingi lookus on 99% heterosügootne, siis on ilmselt tegemist genotüposeerimise/sekveneerimise veaga. Assotsiatsiooni analüüsides, kui küsitakse, kas mõni geneetiline tunnus korreleerub mõne (haiguse) genotüübiga, on mudeli eelduseks HWE (vähemalt kontrollide osas). Haplotüüpide leidmisel kasutatakse EM algoritmi, mis eeldab, et haplotüüp on HWE. Kohtumeditsiin (DNA profileerimine) – võrreldakse kuriteopaigalt leitud ja kahtlusaluse käest võetud DNA profiili. Kui profiilid on identsed,
radioaktiivselt märgistatud isotoopi, selleks et hiljem visualiseerida produkti. Igasse reaktsioonisse lisatakse polümeraasi 4 dNTP ja ühe dNTP tuletisena ddNTP, mis piirab ehk inhibeerib transkriptsiooni. ddNTP-l puudub 3' otsa hüdroksüülrühm (esineb H) ning pärast seda, kui neid lülitakse ahela sisse süntees lõpeb. Igasse reaktsiooni pannakse erinevat ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Siis saadud fragmendid kantakse geeli peale ja teostatakse elktroforeesi, saadakse ,,sekveneerimise treppi", mille abil võib määrata nukleotiidset järjestust. Praegu see protsess on automaatne, mis toimub spetsiaalses masinas, kasutades fluorestsentsi värvust ja detektorit. Arvuti ise loeb järjestuse ära, visualiseerides neid piikidena, iga piik vastutab oma nukleotiidile. Mõnikord kasutatakse dGTP analoogid, kuna need on lihtsama struktuuriga.
d retriktaasiga, mis genereerib "kleepuvad" otsad. (kui nii kloneerimisvektori DNA-d kui ka kloneeritavat DNA-d on lõigatud ühe ja sama restriktaasiga, saame klonerimisvektoi otste vahele "kleepida" uuritava DNA lõigu. Fosfodiestersidemete moodustamiseks kloneerimisvektori DNA ja uuritava DNA lõigu otse vahele kasutatakse ensüümi DNA ligaas) 2. DNA fragment kleebitakse vekroti B-saiti 3. Uus konstrukt viiakse bakterirakkudesse. 45.DNA sekveneerimise põhimõte. DNA nukleotiidse järjestuse määramine.Põhineb DNA fragmentide populatsiooni analüüsil, kus kõik fragmendid algavad samast nukleotiidist, kuid lõppevad sellest statistiliselt erineval kaugusel.Korraga analüüsitakse nelja fragmentide segu, millest ühest lõppevad kõik fragmendid suvalisest G nukleotiidist, teises A nukleotiidist, kolmandas T ja neljandas C. DNA sekveneerimisel kasutatakse nii keemilist kui ensümaatilist meetodit
3)Bakterid võtavad rekombinantsed plasmiidid endasse, saadakse kloonbakterite kogumid 4)Kolooniad eraldatakse. Siiratud fragment(DNA) paljuneb koos bakteritega, saadakse DNA-pank. 47. Mis on cDNA? Kodeeriv DNA e eksonid. Paiknevad eukarüootide geenis vaheldumisis intronite e mittekodeerivate aladega. Neis oleva nukleotiidijärjestuse alusel järjestat ribosoomis aminohapped sünteesitavasse valgumolekuli. In genoomis on cDNAd ainult 2%. 48. DNA sekveneerimise põhimõte. Sekveneerimine on DNA nukleotiidse järjestuse kindlakstegemine. 49. Mille poolest erineb automaatsekveneerimine klassikalisest manuaalsest sekveneerimisest? 50. Polümeraasi ahelreaktsioon. Kindla DNA lõigu kiireks paljundamiseks. Paljundada saab iga DNA lõiku, mille otsjärjestused on teada ning mille järgi on sünteesitud lühikesed 1-ahelalised DNA-lõigud(praimerid). Protsess on
43. Millised on kloonitud DNA-de kasutusalad tänapäeval? Geenide kloonimise abil saab luua suurt hulka geenide või DNA lõikude koopiaid. Seda kasutatakse Geenianalüüsiks a)geeni funktsiooni välja selgitamine b)geeni omaduste hindamine (nt suurus, kudede jaotus), c) jälgida mutatsioonide toimet geeni toimimisele biofarmatseutikaks ehk inimesele vajalike valkude süntees, nt insuliin või kasvuhormoon geeniteraapiaks geneetiliste haiguste ravimiseks 44. DNA sekveneerimise põhimõte. DNA sekveneerimine ehk järjestusanalüüs on monomeeride (nukleotiidide, aminohapete) järjestuse kindlaksmääramine DNA, RNA või valkude molekulides. See annab tulemuseks märkidest koosneva tõlgenduse, mida nimetatakse sekventsiks, ja kirjeldab suuremat osa sekveneeritud molekulist. See on tänapäeva bioteaduses üks olulisemaid tehnikaid. 45. Polümeraasi ahelreaktsioon võimaldab lühikese ajaga paljundada spetsiifilist
Isoleeritakse avalduvate geenid mRNA ning sünteesitakse pöördtranskriptaasiga komplementaarne DNA koopia ehk cDNA, selle kogu sisaldab vaid funktsioneerivate geenide kodeerivaid järjestusi. Viiakse läbi enne kloneerimist. 43. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Ravimitööstuses, kui kloneeritud DNA panna mingi looma sisse, siis loom hakkab tootma valku, nt insuliini saadakse nii. Saab teha transgeenseid organisme. 44. DNA sekveneerimise põhimõte. Sekveneerimine ehk järjestusanalüüs on DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ajalooliselt olid DNA sekveneerimise meetodid põhimõtteliselt kahte tüüpi: 1. Nukleotiidispetsiifiliste katkete tekitamine DNA- ahelas 2. DNA nukleotiiditäpsusega süntees Mõlema metoodika puhul viiakse läbi neli erinevat biokeemilist reaktsiooni, kus reaktsiooni lõpetamisel osaleb üks neljast DNA nukleotiidist. Mõlemad meetodid
G). Tüübid A, B, E ja F põhjustavad inimeste botulismi. Tüübid C ja D põhjustavad loomade ning C ja E lindude haigestumist. Tüübi G haiguspuhanguid ei ole teatatud (Lampel, 2013). Kuigi toksiinid on erinevad, on nad struktuurilt sarnased ja omavad sarnast bioloogilist efekti. Lähtuvalt füsioloogilistest eripäradest jaotatakse liigid veel nelja erinevasse gruppi (I – IV). See on kooskõlas nukleiinhapete hübridisatsiooni ja 16S ribosoomi sekveneerimise uuringutega (Roasto et al, 2011). Organism ja selle spoorid on looduses laialt levinud. Neid on leitud nii kultiveeritud kui metsade pinnasest, veekogude põhjasettest, kalade ja imetajate seedetraktist ning kalade ja koorikloomade lõpustelt ja sisikonnast (Lampel, 2013). Botulism on raskelt kulgev ja mõnikord fataalne haigus, mida põhjustab C. botulinum bakteri poolt toodetav toksiin. Nakatumisele järgneb lihaste, ka hingamislihaste lõtv paralüüs. On teada 3
kasutada restriktaasi, mis hüdrolüüsib C-G järjestusi (näiteks Cfr42I (SacII), CCGC'GG; NotI GC'GGCCGC;). Need restriktaasid on reeglina tundlikud C metülatsioonile C mpG järjestuses, võimaldades restrikteerida seega aktiivseid geene (inaktiivsed võivad olla metüleeritud). Seega on antud töö eesmärgiks kloneerida CpG saarekestel paiknevaid geene, täpsemalt geenide regulaatoralasid ja saadud järjestuste kuuluvus teha kindlaks DNA järjestuste määramise (sekveneerimise) abil. Saadud töö tulemused võivad leida kasutust molekulaargeneetika laboratooriumi teaduslikus uurimistöös. Käesolevas töös saab üliõpilane ettekujutuse genoomse DNA restriktsioonist, kloneermisest, raamatukogu-valmistamisest, PCR reaktsioonist, DNA sekveneerimisest, jt. molekulaarbioloogia põhilistest töömeetoditest. Iga üliõpilane esitab pärast töö teostamist protokolli (kas paberil või elektroonselt), milles toob ära põhilised tulemused ja lisaülesannete vastused
Paljude restriktaasidega lõikamise tulemusel tekivad DNA fragmendid, mille otstes on lühikesed, 2 4 nukleotiidi pikkused üheahelalised alad. Neid nimetatakse kohesiivseteks e kleepuvateks otsteks, kuna nad võivad paarduda teiste sama restriktaasiga lõigatud DNA üleulatuvate otstega. Mõned restriktaasid tekitavad 5' (EcoRI), teised 3' (PstI) üleulatuva otsaga fragmente. On ka restriktaase, mis tekitavad tömpotsalisi fragmente (SmaI). 44. DNA kloneerimise etapid. bläblä 45. DNA sekveneerimise põhimõte. Erinevad DNA molekulid liiguvad erineva kiirusega ja siis mingi lahe süsteem oli. http://www.biotech.ebc.ee/praktikum/juhend3.html 46. Polümeraasi ahelreaktsioon. Äö, praimerid ja värk! Pannakse vajalik(?) jama lahusesse ja imeväel toimub DNA kloneerimine. 47. Kromatograafia. Kromatograafiline meetod põhineb erinevate keemiliste ühendite erinevale tasakaalule kromatograafilise kolonni materjali (sorbendi) pinnale adsorbeerunud ja liikuvas
kahjulikke muutusi kõrvaldavalt, enamik molekulaarmuutusi on organismide suhtes neutraalsed ega allu valikule ja organismi valgud evolutsioneeruvad kindla autonoomse kiirusega. Geenijärjestuste uurimine alates 1970-ndad Zurkerkandl ja Pauling: postuleerisid molekulaarse kella idee Terviklike organismide genoomse DNA järjestuste määramine Neutralistlik evolutsiooniteooria tekitas uue pöörde loodusliku valiku ja mutatsionismi vahekordade mõistmisel ning geenide kloneerimise, sekveneerimise ja amplifitseerimise meetodite leiutamine ja võimalus juba eelnevalt Zurkerkandli ja Paulingu poolt postuleeritud molekulaarse kella idee kasutamiseks fülogeneesi rekonstruktsioonil, muutsid pildi täielikult. Uusi terviklikke genoomse DNA järjestusi (esialgu küll mikroorganismide tasandil, kuid kohe-kohe ka enamal) tuleb juba ridamisi - kolossaalne toormaterjal evolutsiooniprotsesside mõistmiseks. Neutraalse evolutsiooniteooria argumendid:
määratletud tingimustes) sünteesitud DNA-molekul. 42. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Luuakse mudelhiired, et nende peal katsetades leida ravimeid erinevatele haigustele, võimalik on säilitada hävimisohus olevaid liike, toodetakse valke, uuritakse geeni struktuuri, huvipakkuvaid DNA fragmente saab uurimiseks lõputult paljundada, kloonitakse aiasaaduseid ja taimi, kloonitakse tüvirakke ravieesmärgil. 43. DNA sekveneerimise põhimõte selle protsessi käigus selgitatakse välja DNA nukleotiidne järjestus. 44. Polümeraasi ahelreaktsioon PCR-reaktsioon toimub kolmes etapis: 1. DNA ahelate denatureerimine. Kui DNA on rakust eraldatud ja puhastatud, võib alustada PCR-analüüsi. DNA denatureerimiseks kuumutatakse DNA-d 9095 °C juures, mille käigus DNA biheeliks laguneb kaheks üksikahelaks. See on vajalik huvipakkuvate fragmentide paljundamiseks. PCR-i puhul on vaja teada lühikesi
GWAS meta-analüüsides on kombineeritud mitmete väiksemate GWAS-ide statistilised tulemused, saades tulemuseks analüüsi, millel on suurem statistiline võimsus. 16. Miks oli oluline inimgeneetika loengus rääkida metaboloomikast? Metaboloomika uurib teatud väikese molekulmassiga orgaaniliste molekulide kogumeid (nt metaboliidid, antibiootikumid jne). Inimgeneetikas oluline metabolismi ja selle häirete uurimiseks. 17. Kirjelda teise põlvkonna sekveneerimise proovi ettevalmistamise etappe! Millele tuleb tähelepanu pöörata ning mis võib põhjustada proovi halva kvaliteedi? DNA purustatakse, et saada fragmendid. Siis liidetakse neile mõlemasse otsa ühenukleotiidilised A otsad ehk adenüleeritakse ning siis ligeeritakse sinna külge adapter-oligonukleotiidid. Saadud fragmendid selekteeritakse suuruse järgi ja puhastatakse. Sellele järgneb klastrite genereerimine Flow-cell’is. Flow-cell põhjas on
CCCCATACGAGGCCTACAAGAGGGGCATCATCGACAGGGGCCAGTACTTGC AGCTGCAGGAGCTCGAGTGTGACTGGGAGGAGGTCACCACCTCGGGGCCCT GTGGGGAGGAGTCTGTGCTCCTGGACCGCAAGAGCGGGAAGCAGTACTCCA TCGAGGCCGCCCTCCGCTGCCGGCGCATCTCTAAGGAGGAGTACCATCTGT ACAAGGACGGCCACCTGCCCATCTCCGAGTTTGCGCTGCTTGTAGCTGG GG AGACCAAGCCAAGCTCCGGATCCA Tumedaga allajoonitud osa on vektoris tagurpidi. Sinisega märgitud A kohal on toimunud mutatsioon, selle asemel on C. Selle tulemusel muutub ka valgu järjestus. b) Sekveneerimise tulemuse järgi kloneerisin inimese envoplakin geeni (Homo sapiens envoplakin (EVPL)) c) i. Saadud sekventsi pikkus oli 1049 bp. Sekventsi algus ning lõpp olid kehvema kvaliteediga, keskmise osa kvaliteet oli küllaltki hea, piigid joonistusid selgelt välja ning olid loetavad. ii. Sekveneeritud sai terve sisestatud insert. iii. Järjestuses on tekkinud üks punktmutatsioon, kus A on muutunud C-ks. See muudab ka aminohapet E asemel sünteesitakse A. 8
1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. 43. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. vt. konspekt (05.11) 44. Mille poolest erineb automaatsekveneerimine klassikalisest manuaalsest sekveneerimisest?
Avaldades kolonnile survet (rõhku), siis nim seda HPC'ks (High Pressure liquid Chromatograpy'ks). HPC puhul saab sisuliselt väga keerulisest segust erisatda suvalisi molekule. Elektroforees on sisuliselt kromatograafia edasiarendus. Tänapäeval kasutame üldjuhul sellised plaat-elektroforeesi masinaid, et saaks korraga palju prove üksteise kõrvale kanda, siis põhimõtteliselt võime ka kolonni rakendada elektrivälja. /vaadata meetodi kohta sekveneerimise juures/. Kõik nukleiinhapped on alati negatiivse laenguga, seega liiguvad alati +elektroodi poole. Valgu molekulidel võivad olla erinevad laengud, sest erinevatel aminohapetel on erinevad laengud, mis annavadki erineva iseloomu, on olemas selliseid aminohappejääke, mis annavad negatiivseid ja positiivseid laenguid ja ka neutraalseid. Tahtes valgumolekule elktroforeetiliselt üksteisest
2. Rakendusliku poole pealt on võimalik panna rakke sünteesima kloonitud geeni poolt kodeeritud valku tööstuslikel/kliinilistel eesmärkidel. Nt. kasutusel rekombinantsed DNA molekulid, kuhu kloonitud insuliini geen. Selline DNA viiakse laboritingimustes kasvavatesse rakkudesse, kus algab insuliini süntees. Sünteesitud insuliin on võimalik välja puhastada ja seda kasutatakse diabeedi ravis. 44. DNA sekveneerimise põhimõte Ehk järjestusanalüüs on monomeeride järjestuse kindlasmääramine informatsiooniliste biopolümeeride (DNA, RNA, valkude) molekulides. 45. Polümeraasi ahelreaktsioon Viimase mõnekümne aasta üks olulisemaid läbimurdeid DNA analüüsi valdkonnas. Töötas välja Kary Mullis 1983. Lühidalt võimaldab PCR ka väga väikest kogust DNA'd paljudnda mitme suurusjärgu võrra. Paljundatakse pikast DNA molekulist korduvalt ainult mingit konkreetset lõiku.
4. Pipeteerisin kogu oma segu agaroosgeeli hambasse. 5. Tehtud pildist oli arusaadav, et ma ei saanud õige kõrgusega bändi. Nagu selgus, viga oli bakterite kasvamisel ja meil kasvanud bakterite kolooniad polnud tegelikult õiged. Võib olla põhjus selles, et ampitsiliin polnud nii effektiivne ja selektiivne. Need bakterid võiksid sattuda meie tassidele õhust, kuna selles praksiruumis tehakse töid paljude teiste preparaatidega. 63. 64.Sekveneerimise tulemuste analüüs 65. Tavaliselt kontrollitakse saadud plasmiidi kasutades Sangeri meetodit. See meetod põhineb PCR reaktsioonil kuhu on lisaks tavaliste nukleotiidalustele lisatud ka selliseid aluseid, mis om märgitud fluorokroomiga ja mille nukleotiidi ahelasse lülitamise järel DNA pol antud ahela pikendamise lõpetab. Kuna iga terminaalne ddNTP on märgitud erineva fluorokroomiga saab DNA järjestuse teada lahutades saadud reaktsiooni
etappid oli teostatud õigesti ja katte saadud plasmiidne DNA sisaldab õige järjestusi ja saadud plasmiidi täpsemaks analüüsimiseks on vaja see sekvineerima. 1) Sekveneerimise tulemuste analüüs Mina valisin analüüsimiseks sekvents nr 13 L-Desmo_t7_e02 (tõenäoliset saadud minu plasmiidist, kuna märgistasin oma pridukti L tähega). Kopeerisin sekvensi Chromast Blasti ja võrreldades Word failis oleva järjestusega, sain teada, eti minu insert kleepus vektoriga kokku valepidi, ehk mul tegu on reverse complementiga. Selleks, et
elu ei vaja peptiidsidet lihtsalt suvalises polüpeptiidis, vaid kindla aminohappelise järjestusega valgus. Kindla järjestusega polüpeptiidil on kõrge hind entroopia näol 41. Ligikaudu mitu erinevat valku on inimeses? 50000 42. Teatud juhtudel võib valkudes esineda fosforüleeritud seriinijääk. Kas seriinijäägi fosforüleerimine toimu enne või pärast seriini lülitamist polüpeptiidahelasse? Pärast seriini lülitamist 43. Millist polümeeri struktuuri tasandit määratakse sekveneerimise abil? Primaar 44. Kas peptiidsideme ümber on võimalik polüpeptiidahela vaba pöörlemine? Põhjendage. Ei ole 45. Joonistage toodud aminohapete baasil dipeptiid trans konfiguratsioonis ?? 46. Näidake (noolega) milliste sidemete ümber on võimalik polüpeptiidahela vaba pöörlemine. Polüpeptiidahela pöörlemine on võimalik ainult N - C ja C C sidemete ümber 47.
· C von Niel uuris bakteriaalset fotosünteesi; tõestas, et bakterid saavad kasutada fotosünteesil erinevaid väävliühendeid, vesinikku ja org ühendeid; tõestas, et taimede fotosünteesist eralduv O2 on pärilt H2O-st; pakkus koos R. Stanieriga välja konseptsiooni et kogu elusloodus jaguneb pro- ja eukarüootideks. · A. Fleming avastas antibiootikumid; avastas ja puhastas penitsilliini · C. Woese algatas 1977a rRNAde sekveneerimise ja saadud tulemuste kasutamise bakterite fülogeneesi uurimisel; avastas arhed · R. Blakemore avastas 1970 a magnetosoomid · Pfeiffer - 1893a. Jagas toksiinid endo- ja eksotoksiinideks · C. Ehrenberg - 1836 a avastas viburid Elu tekke ajal oli atmosfääris: · Vähe O-te · CH, CO, N, NH, CO, H · Kõrge temp · Ere valgus · Tugev vulkaaniline tegevus · UV kiirgus · Meteoriitide rünnakud Abiootilise sünteesi kahtlejate vastuväited:
1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 38. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. 39. Polümeraasi ahelreaktsioon PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks
1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 38. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. 39. Polümeraasi ahelreaktsioon PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks
rohkem energiat? V: Sest ei ole vaja lihtsalt peptiidsideme sünteesi suvalises polüpeptiidis vaid peptiidsideme sünteesi kindla aminohappe järhestusega valgus. 41. Ligikaudu mitu erinevat valku on inimeses? a) 500 b) 5000 c) 50000 42. Teatud juhtudel võib valkudes esineda fosforüleeritud seriinijääk. Kas seriinijäägi fosforüleerimine toimub enne või pärast seriini lülitamist polüpeptiidahelasse? 43. Millist polümeeri struktuuri tasandit määratakse sekveneerimise abil? a) primaar b) sekundaar c) tertsiaar d) kvaternaar 44. Kas peptiidsideme ümber on võimalik polüpeptiidahela vaba pöörlemine? Põhjendage. V: Kuna peptiidsidemel on suuresti kaksiksideme iseloom, siis ei ole peptiidsidemes C-N vahelise sideme ümber võimalik aatomite vaba pöörlemine. 45. Joonistage toodud aminohapete baasil dipeptiid trans konfiguratsioonis. (võivad olla erinevad aminohapped). Histidiin fenüülalaliin 46
1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 42. DNA sekveneerimise – selle kohta Pata slaidides DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus, need saab siis tuvastada. 43. Polümeraasi ahelreaktsioon
1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 42. DNA sekveneerimise selle kohta Pata slaidides DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus, need saab siis tuvastada. 43. Polümeraasi ahelreaktsioon See oli revolutsioon molekulaarbioloogias, sest võimaldab eksponentsiaalselt DNA-d paljundada
Struktuurne kollageen Reserv kaseiin Kontraktsioon aktiin, müosiin Kaitse (antikehadena) immunoglobuliinid Adaptor e toes AKAP-valgud (siduvad valgud, proteiinkinaasid) Eksootilised funktsioonid antifriisvalgud kalades Valkude analüüsi meetodid. Valkude aminohappelise järjestuse määramiseks kasutatava sekveneerimise strateegia ja etapid. Valgu aminohappejärjestust saab määrata kahel viisil: - Valgu reaalne sekveneerimine - Valku kodeeriva geeni DNA sekveneerimine ning selle põhjal valgu järjestuse tuletamine. Valgusekveneerimine koosneb 7 etapist: 1) Mitme polüpeptiidahela korral lahutada ahelad 2) Katkestada (taandada või oksüdeerida) disulfiidsidemed 3) Määrata N ja C terminaalsed jäägid
) 5. Kirjelda Hardy Weinbergi tasakaaluvõrrandi peamiseid kasutusalasid tänapäeval. Milline on üldine empiiriline tähelepanek, mis lubab HW-d kasutada suurte populatsioonide (nagu inimene) struktuuri uurimisel? Mis võiks selle põhjus olla? (Sille) Tohutute andmehulkade juures mida täna produtseeritakse on HWE üks kvaliteedi kontrolli etappe. Kui ikka mingi lookus on 99% heterosügootne, siis on ilmselt tegemist genotüpiseerimise/sekveneerimise veaga. (700 täisgenoomi andmetes: 40 miljonit varieeruvat saiti ja 14 000 neist viskasime HWE testiga välja). Assotsiatsiooni analüüsides, kui küsitakse, kas mõni geneetiline tunnus korreleerub mõne (haiguse) fenotüübiga, on mudeli eelduses HWE (vähemalt kontrollide osas). Haplotüüpide leidmisel kasutatakse EM algoritmi, mis eeldab, et haplotüüp on HWEs. Kohtumeditsiin (DNA profileerimine). Paljudes populatsiooni
41.(136) Ligikaudu mitu erinevat valku on inimeses? c) 50000 42.(137) Teatud juhtudel võib valkudes esineda fosforüleeritud seriinijääk. Kas seriinijäägi fosforüleerimine toimu enne või pärast seriini lülitamist polüpeptiidahelasse? Pärast seriini lülitamist polüpeptiidahelasse. Seriini fosforüleerimine ATP poolt kas aktiveerib või passiveerib valku, näit. glükogeeni fosforülaasi. 43.(138) Millist polümeeri struktuuri tasandit määratakse sekveneerimise abil? a) primaar 45.(140) Kas peptiidsideme ümber on võimalik polüpeptiidahela vaba pöörlemine? ei ole 46.(141) Joonistage toodud aminohapete baasil dipeptiid trans konfiguratsioonis. Sarnaselt C=C kaksiksidemele võivad ka peptiidsidemega külgnevad koplanaarsed grupid asetseda teineteise suhtes kas, cis või trans konfiguratsioonis. Peptiidside on oma struktuurilt planaarne ja eelistatud on peptiidsideme trans vorm. Cissamal "pool", Transdiagonaalis erinevatel "pooltel" 48
Abstraktses mõttes on ta seal vast alati olnud, kuid alles viimaste aastakümnete suured muudatused, eriti aga viimased kümmekond aastat on andnud bioloogiale vahendid, mis on revolutsioneerinud evolutsiooniprotsesside rekonstrueerimise võimalused. Seitsmekümnendate alul eelkõige tänu Motoo Kimura populatsiooniteoreetilistele töödele tekkinud neutralistlik evolutsiooniteooria tekitas uue pöörde loodusliku valiku ja mutatsionismi vahekordade mõistmisel ning geenide kloneerimise, sekveneerimise ja amplifitseerimise meetodite leiutamine ja võimalus juba eelnevalt Zurkerkandli ja Paulingu poolt postuleeritud molekulaarse kella idee kasutamiseks fülogeneesi rekonstruktsioonil, muutsid pildi täielikult. Uusi terviklikke genoomse DNA järjestusi (esialgu küll mikroorganismide tasandil, kuid kohe-kohe ka enamal) tuleb juba ridamisi - kolossaalne toormaterjal evolutsiooniprotsesside mõistmiseks. Ja lisaks muidugi veel
http://www.biomed.drexel.edu/new04/Content/news_events/display_event.cfm?EVENT_ID=238 42.(137) Teatud juhtudel võib valkudes esineda fosforüleeritud seriinijääk. Kas seriinijäägi fosforüleerimine toimu enne või pärast seriini lülitamist polüpeptiidahelasse? Pärast seriini lülitamist polüpeptiidahelasse. Seriini fosforüleerimine ATP poolt kas aktiveerib või passiveerib valku, näit. glükogeeni fosforülaasi. 43.(138) Millist polümeeri struktuuri tasandit määratakse sekveneerimise abil? a) primaar b) sekundaar c) tertsiaar d) kvaternaar 44.(139) Kas joonisel on kujutatud valgu primaar, sekundaar, tertsiaar või kvaternaarstruktuur? (võivad olla erinevad joonised). Vaadake "Valkude struktuur" joonis 7.27 45.(140) Kas peptiidsideme ümber on võimalik polüpeptiidahela vaba pöörlemine? ei ole 46.(141) Joonistage toodud aminohapete baasil dipeptiid trans konfiguratsioonis. (võivad olla erinevad aminohapped).
Järjestuse analüüs paljastas, et inimesel on umbes 20 000-25 000 geeni. Inimese terve nukleotiidse järjestuse teadmine annab võimaluse leida haiguse tekkes osalevaid geene ning õppida paremini tundma haiguste tekkemehhanisme. Samuti aitab see teadmine tulevikus võimaldada personaalset meditsiini ehk genotüübist sõltuvat ravistrateegiat. 57. Mis on massiivne paralleelne sekveneerimine (massive parallel sequencing) NGSi ehk massiivse paralleelse sekveneerimise esimeseks etapiks on genoomse DNA fragmenteerimine väiksemateks lõikudeks, millest seejärel koostatakse raamatukogu. Raamatukogu lõigud kantakse kandjale, kus toimub DNA fragmentide seondumine kindlate proovidega ja kaksikahela denaturatsioon üheahelaliseks. Edasiselt sünteesitakse uuritavale üheahelalisele DNA järjestusele vastasahel. Iga üksiku nukleotiidi lülitamisel sünteesitavasse ahelasse saadakse valgussignaal, mis registreeritakse arvuti abiga. Sellisel
elavad, vaatamata funktsioonile. Seega endofüüdid on kõik mikroorganismid, mis teatud eluetapil või terve elu elavad taimekudedes. 16.2. Endofüüdid Endofüütseid baktereid on leitud väga erinevatest taimehõimkondadest: lehtsammaltaimedest (Bryophyta), sõnajalgtaimedest (Pteridophyta), paljasseemnetaimedest (Gymnospermae) ja katteseemnetaimedest ehk õistaimedest (Angiospermae). Taimedest on leitud väga palju erinevatest hõimkondadest baktereid. 16S rRNA sekveneerimise abil on kirjeldatud taimede kudedest 21 eubakterite hõimkonda ja 2 arhede hõimkonda, nagu näiteks Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chlamydiae, Frimicutes, Proteobacteria, Spirochaetae jpt. Kuigi taimedes on väga kirju seltskond baktereid, moodustavad valdava osa endofüütidest ainult 4 hõimkonna liigid: Proteobacteria (54%), Actinobacteria 140 (20%), Firmicutes (16%) ja Bacteroidetes (6%)
annaabi.ee 
