Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine (0)

Lauri Mölder
112938
Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine

Teooria

Taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides jt fotosünteesivates organismides sisalduvad fotosünteesi abipigmentidena karotenoidid , mis absorbeerivad valgust klorofüllist mõnevõrra erineval lainepikkusel ja on täiendavateks kiirguse retseptoriteks. Struktuurilt on karotenoidid polüeensed ahelad , mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid. Jaotatakse kahte põhigruppi – karoteenid, kui hapnikku mittesisaldavad molekulid, mis koosnevad ainult süsinikust ja vesinikust ja ksantofüllid, kui hapnikku sisaldavad molekulid. Taimedes täidavad karotenoidid ka ka kaitsvat rolli neelates liigset valgusenergiat ning kaitstest rakke fotokahjustuse eest. Karotenoidid omavad iseloomulikke neeldumismaksimume apolaarsetes lahustites , mistõttu on võimalik optilise tiheduse järgi määrata karotenoidi tüüpi.

Töö käik

• Õppejõult saadi prooviks tükike peterselli
  
• Petersellist kaaluti 0,5g kaalutis ning viidi see kadudeta uhmrisse
  
• Lisati pestud liiva ning peenestati proov
  
• Lisati väikeste koguste kaupa veevaba Na2SO4, kuni proov oli täiesti kuiv
  
• Proov ekstraeeriti heptaaniga ning filtriti kuiva 50ml mõõtesilindrisse, ekstraenti koguti 26ml
  
• Määrati proovi neeldumisspekter vahemikus 350-650nm
  

Neeldumisspekter
Tippudest mõõdetud optiline tihedus:

469,5nm – 0,5934A

442,0nm – 0,6586A

419,5nm – 0,4492A
Neeldumispektri põhjal tuvastati tabelist, et aine sarnaneb enim α-karoteeniga, mille neeldumismaksimumid on lainepikkustel 475nm, 445nm ja 420nm. Leiti ka Excm = 2735(@445nm)
Arvutused

Analüüs

Kirjanduse alusel võiks petersell sisaldada kuskil 4mg α- karoteeni , mida on pea kaks korda enam, kui mina seda tuvastasin. Viga võis sisse tulla, kas millegi mõõtmisel või on petersellist vananemise tulemusel (petersell oli närtsinud olemisega) osa karoteenist ära kadunud. Samuti ei klappinud neeldumisspektrid täpselt, mille põhjuseks võis olla samuti vananemine . Eeldusel , et petersell kaotab vananedes osa oma α-karoteenist, võib töö lugeda õnnestunuks, vastasel juhul on viga ligi kahekordne ja tulemustega ei saa mitte rahul olla.
Lipiidide reaktsioonid

Teooria

Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti estersidemete esinemine. Reeglina ei lahustu lipiidid vees ja vesilahustes, vadi apolaarsetes orgaanilistes solventides. Vähemal määral lahustuvad nad polaarsetes solventides. Lipiidid on organismides rakumembraanide põhiliseks koostiskomponendiks, loomsetest oranismides, aga ka mitmetes taimsetes kudedes peamiseks energeetiliseks varuaineks. Lisaks sellele on niel ka kaitse- ja regulatoorsed funktsioonid, nad on signaalmolekulideks ning mängivad olulist rolli hormonaalses tasakaalus. Lipiidid klassifitseeritakse vastavalt molekuli ehitusele ja omadustele: rasvhapeteks, rasvadeks , glütserofosfolipiidideks, sfingolipiidideks, vahadeks, steroidideks, terpenoidideks.
Rasvad e. Triatsüülglütseroolid on keemiliselt ehituselt rasvhapete glütserüülestrid. Hüdrofoobsed rasvamolekulid sobivad toiduenergia säilitamiseks, olles loomades akumuleerunud rasvadepoodesse, kõrgemates taimedes seemnetesse. Naturaalsetes rasvades sisaldub lai valik erinevaid, nii küllastunud kui küllastumata rasvhappeid .
Kõikide rakumembraanide peamiseks koostisosaks olevad glütserofosfolipiidid kujutavad endast amfifiilseid molekule, sest lisaks kahele rasvhappe radikaalile, mis annavad molekulile hüdrofoobsuse, sisaldavad nad fosforhappe jääki, mille kaudu seonduvad erinevad aminoalkoholid ja mille tulemusena moodustub molekulis polaarne tsenter. Just amfipaatsuse tõttu saavad need lipiidid moodustada vesikeskkonnas struktuure, nagu membraanid, vesiikulid või liposoomid.
Steroolide ehk steroidalkoholide ehituslikuks aluseks on steraanituum, st tsüklopentanoperhüdrofenantreen, mis asendis C-3 on hüdroksüleeritud. Seetõttu on steroolid võimelised moodustama rasvhapetega estreid, mida tuntakse steriidide nime all. Levinuim loomne sterool on kolesterool , mida leidub pea kõikide loomsete rakumembraanide koostises ja mis tagab membraanide läbitavuse ja liikuvuse/voolavuse.

Rasvapleki proov

Kõikide lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites. Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk , millest paberi läbipaistvus suureneb. Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam .

Töö käik

Võetakse kahte kuiva katseklaasi 1g erinevat tahket ainet. Mõlemasse katseklaasi lisatakse 0,5ml atsetooni . Loksutatakse hoolikalt ning lastakse tahel ainel settuda umbes 5 minutit. Mõlemast katseklaasist kantakse pipetiga tilk filterpaberile ja lastakse kuivada. Esimesest katseklaasist võetud proov sisaldas lipiide, sest paberile jäi rasvane laik – järelikult sisaldab lahus lipiide, teisest katseklaasist võetud lahus mingeid jälgi ei jätnud, mistõttu lahusest puuduvad lipiidid.

Emulsioonitest

Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide nime all. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises vedelikus . Kuna emulsioonid hajutavad läbivat valgust, siis emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks.

Töö käik

Kahte kuiva katseklaasi valati 2ml uuritavat lahust, mida oli eelnevalt etanooliga lahjendatud. Katseklaase loksutatakse homogeense sademe moodustumiseni. Lisatakse mõlemasse 4ml destileeritud vett ja loksutatakse uuesti. Esimeses katseklaasis tekkis valkjas sade, mis tõestab glütseerüülestrite olemasolu, teises aga muutusi ei toimunud, mistõttu puuduvad sealt glütserüülestrid.

Akroleiiniproov

Glütserooli (propaantriooli) kuumutamisel, eriti vett siduvate ainete juuresolekul, tekib terava lõhnaga küllastamata aldehüüd propenaal ehk akroleiin . Sama reaktsiooni annavad rasvad ja glütserofosfolipiidid, kuid ei anna glütserooli mittesisaldavad lipiidid (vahad, sfingolipiidid jt). Seega võimaldab akroleiini moodustumine otsustada, kas tegemist on glütserooli sisaldava või mittesisaldava lipiidiga.

Töö käik

Kahte kuiva katseklaasi kantakse 1g KHSO4 ja lisatakse mõni tilk kahest erinevast uuritavast materjalist. Katseklaase kuumutatakse tõmbekapis gaasipõletil kuni soola sulamiseni ja proovi tumenemiseni. Esimene proov lõhnas imalalt, mis tõestas akroleiini olemasolu. Järelikult esimeses lahuses oli glütserofosfolipiide. Teine proov lõhnas nagu kummikärashais, järelikult akroleiini ei tekkinud. Järelikult teises lahuses olid glütserooli mitte sisaldavad lipiidid.

Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides

Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse analoogiliselt süsivesinike uurimisega reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus võib küll veidi lahjeneda, kuid ei kao, samas aga küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus toimuva liitumis-reaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.

Töö käik

Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valati igasse 2ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis . Esimesse plamithapet, teisse oliiviõli ja kolmandasse searasva. Kõikidesse katseklaasidesse lisatakse tilkhaaval (10 tilka) broomi lahust kloroformis ning loksutatakse ja jäetakse mõneks ajaks seisma. Esimeses katseklaasis, kus oli palmithape jäi broomi värv püsima, mis tõestab küllastunud rasvhapete olemasolu. Teises katseklaasis, kus oli oliiviõli muutus lahus läbipaistvaks, mis tõestab küllastumata rasvhapete olemasolu. Kolmandas katseklaasis, kus oli searasv muutus lahus kollakaks, mis tõestab mõlemate - nii küllastunud kui küllastumata rasvhapete olemasolu.

Kolesterooli määramise test

Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil identifitseeritud arvukalt (kuni 20) reaktsiooniprodukte, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset rida transformatsioone: toimub steraanituuma oksüdeerumine, mis viib küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine erinevates punktides. Lõppkokkuvõttes 30 tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu. Samas aga positsioonis C17paiknev süsivesinikradikaal reaktsioonis ei osale.

Töö käik

Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse igasse 2ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis – kolesteroolilahust, taimse ja loomse rasva lahust. Esimesse katseklaasi valati kolesteroolilahus, teise oliiviõli lahus ja kolmandasse searasva lahus. Igasse katseklaasi lisatakse 6-7 tilka äädikhappe anhüriidi ja 4-5 tilka konsentreeritud väävelhapet ning loksutatakse. Esimeses katseklaasis, kus oli kolesterool muutus rohekaks, mis tõestas kolesterooli olemasolu tema enda lahuses. Teises katseklaasis, kus oli oliiviõli muutus kerget kollakaks, mis tõestas fütosteroolide olemasolu lahuses. Kolmandas katseklaasis, kus oli searasv jäi värvituks, mis tõestas, et sealt puudub kolesterool.