Alternatiivne RNA splaissimine pre-mRNA võib saada splaissitud mitmetest erinevatest ühenduskohtadest, nii et tekivad erinevad küpsed mRNA-d, millel on erinevad eksonite kombinatsioonid Prokarüootidel on geeni poolt määratav esmane transkript võrdne mRNA-ga ning ta on ka kohe transleeritav. Eukarüootides toimub aga esmalt eellas- ehk pre- mRNA süntees, misjärel toimub nn. eellas-mRNA protsessing küpseks mRNA- molekuliks. 12. Pre-mRNA kokkupõime ehk splaissingu reaktsioon * Kirjelda mehhanismi, mille abil pre-mRNAst kõrvaldatakse intronid. splaissing (ka splaising; inglise splicing) protsess, mille käigus lõigatakse rakutuumas asuvast RNA molekulist välja intronjärjestused ning allesjäänud eksonite otsad ühendatakse. Splaissingu tulemusena tekib mRNA, mida kasutatakse translatsioonil korrektse proteiini sünteesiks. Eukarüootsete intronite puhul katalüüsib splaissimisreaktsioone splaissosoom, kuid olemas on ka isesplaissuvaid introneid
retseptorite plasma membraane, ja võib esindada teist tundetuks muutumise faasi. 4. Alla-regulatsioon esineb rakkude pikendatud ekspositsiooni jooksul agonistidele, ja võib olla vahendatud suurendatud degradeerimise ja retseptorite kahanenud sünteesi poolt. 50. Mehanismi, mille abil tuumsest pre-mRNAst kõrvaldatakse intronid. Intronite väljalõikamine võib toimuda kolme erineva mehhanismi alusel: (1) tRNA prekursorite puhul teeb katked RNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ning eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. Need ensüümid tunnevad spetsiifiliselt ära tRNA prekursormolekuli kõrgemat järku struktuuri, mitte aga spetsiifilist nukleotiidset järjestust. (2) Osade rRNA prekursorite puhul (paljudes madalamates eukaüootides, näit. Tetrahymena thermophila samuti ka rakuorganellides) kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt, RNA molekuli enda poolt
termineerumine sarnaselt bakterites toimuva Rho-valgust sõltuva terminatsiooniga. 60. Võrrelge eukarüootsete ja prokarüootsete geenide struktuuri. Eukarüootse RNA transkriptsioonijärgne modifikatsioon. Eukarüootsetel geenidel on olemas intronid ehk mittekodeerivad alad. Sellest tulenevalt on tarvis eukarüootide RNA’d muuta enne valgu sünteesi. RNA-st lõigatakse mittekodeerivad alad välja. Seda protsessi nimetatakse splaissinguks. 61. Intronite kõrvaldamine splaissingu teel. 1. tRNA prekursorite puhul teeb katked RNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ning eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. Need ensüümid tunnevad spetsiifiliselt ära tRNA prekursormolekuli kõrgemat järku struktuuri, mitte aga spetsiifilist nukleotiidset järjestust. 2. Osade rRNA prekursorite puhul kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt, RNA molekuli enda poolt
ensüüm polü(A) polümeraas RNA molekuli 3´-otsa polü-A saba, mis koosneb kuni 200-st adenosiinmonofosfaadist. Polü-A sabad suurendavad mRNA molekulide stabiilsust ja neil on ka oluline roll RNA transpordil tuumast tsütoplasmasse. 60)Võrrelge eukarüootsete ja prokarüootsete geenide struktuuri. Eukarüootse RNA transkriptsioonijärgne modifikatsioon. Eukarüootsetes geenides paiknevad kodeerivate alade vahel mittekodeerivad alad, mida nimetatakse introniteks. 61)Intronite kõrvaldamine splaissingu teel. Intronite väljalõikamine võib toimuda kolme erineva mehhanismi alusel: 1) tRNA prekursorite puhul teeb katked RNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ning eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. Need ensüümid tunnevad spetsiifiliselt ära tRNA prekursormolekuli kõrgemat järku struktuuri, mitte aga spetsiifilist nukleotiidset järjestust. 2) Osade rRNA prekursorite puhul kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt, RNA molekuli enda
Pre-mRNA- 5'müts, eksonid, intronid, kaitsev 3' saba millel Poly(A) järjestus. Pre-mRNA allutatakse splaissingule-tekib küps mRNA mille tunnuseks on 5' cap ja 3' saba. RNProteins tunnevad ja detekteerivad RNAd tekib RNParticle. AG reegel- Ülavoolu: Intron algab GUga, ekson lõppeb AGga; Alavoolu: ekson algab Gga, intron lõppeb Agga. Splaissosoom- kompleks mis peab moodustuma 5 ´3' liidesesse. Selleks on eksonitel mingid järjestused mille splaissosoomi valgud (Srvalgud) ära tunnevad. Splaissingu aktiivsust reg. Fosforüleerimine (fosfataasid-võtavad ära, kinaasid- panevad juurde). Geeni reg- kromosoomi üleminek valguks. Tsentromeer- hoiab koos kahte kromatiidi. Telomeerid- hoiavad kromosoomi otsi tugevana, et mitte lasta kromosoomil lüheneda ja pärilikkusel kaduda. Eukromatiin- lõdvalt pakitud , aktiivse transkrip. ala. Heterokromatiin- tugevalt pakitud, transkr. ei toimu. Operon- erinevaid valke kodeerivad alad. Speiser- geenide vaheline ala. Prokarüoodi geenis puuduvad
Eukarüootse RNA transkriptsioonijärgne modifikatsioon. Enamasti paiknevad kodeerivate alade (= eksonid) vahel mittekodeerivad alad (= intronid), st eukarüootsed geenid moodustuvad katkendlikest kodeerivatest järjestustest. Prokarüootsed geenid koosnevad pidevatest kodeerivatest järjestustest. Eukarüootses rakus toimub primaarse transkripti (pre-RNA) protsessimine transleeritavaks mRNA molekuliks. Intronid eemaldatakse splaissingu teel. 60. Intronite kõrvaldamine splaissingu teel. On olemas 3 erinevat mehhanismi: 1) tRNA prekursorite puhul teeb katked TNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ning eksoneis sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. Need ensüümid tunnevad spersiifiliselt ära tRNA tRNA prekursormolekuli kõrgemat järku struktuuri, mitte aga spetsiifilist nukleotiidset järjestust. 2) Osade rRNA prekursorite puhul kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt, RNA molekuli enda poolt
ümberpaigutuda tuuma keskele poole. Interkromatiini kanalid algavad tuumapooridest ning laienevad kromatiini territooriumite võrgustiku vahel nagu suuremad kanalid ja laguunid. Ehk laieneva suurusega mittekromatiinsed domeenid lükkavad ümbritsevad kromatiini fiibrid kõrvale ja suurendavad interkromatiini ruumi laguunideks. Interkromatiini kompartmendis liiguvad vabalt transkriptsiooni- ja splaissingu faktorid. DNA-vaba võrgustik laieneb kromatiini võrgustiku vahel, interkromatiini kanalid algavad tuumapooridest ning laienevad nii CT-de perifeeriasse kui ka nende sisemusse. Sisemised laiemad IC laguunid sisaldavad splaissingu faktoreid. 5 • CT-de detailsem struktuur: kromatiini domäänid (CD)=fraktaalsed gloobulid= ‘chromatin liquid drops’; periromatiinne piirkond.
introniteks. Neid geenijärjestusi, mis jäävad mRNA koostisesse pärast splaissingut, nimetatakse eksoniteks. Intronite sisaldus ja pikkus varieerub geeniti. Intronite pikkus võib varieeruda 50-st nukleotiidist tuhandeteni. Prokarüootidel puuduvad intronid ja histoonid. Eukarüootses rakus toimub primaarse transkripti, pre-RNA, protsessimine transleeritavaks mRNA molekuliks. Intronid eemaldatakse splaissingu teel. Enne splaissimist lisatakse pre-mRNA-le 5´-otsa 7-metüülguanosiin ja 3´- otsa polü-A järjestus polüA saba, mis on 20-200 nukleotiidi pikk. 61. Intronite kõrvaldamine splaissingu teel. Selleks, et splaissitud mRNA kodeeriks funktsionaalset valku, peab splaissingu protsess toimuma väga täpselt. Intronite väljalõikamine võib toimuda kolme erineva mehhanismi alusel:
ekspressiooni. 36. Nonsense-mRNA vahendatud lagundamine(NMD). a. Esineb tsütoplasmas, vahendab kiiret mRNAde lagundamist, kus stopkoodonid esinevad mRNAs enne viimast splaissimisliidest. 37. Mis vahe on inteiinil ja intronil? a. Inteiin kindel sisemine valgu osa, mis lõigatakse välja valkude splaissimisel. b. Intron eukarüootse geeni mittekodeeriv piirkond, mis trankribeeritakse RNA-ks, ent seejärel lõigatakse splaissingu tulemusena välja. 38. Mis juhtub, kui polüadenülatsiooni motiivis (AAUAAA) või RNAP II CTD alas on mutatsioon? a. CTD mutatsioon takistab seondumist TF-de ja DNA-ga, inhibeerib transkriptsiooni. TF-d ei seondu. b. AAUAAA mutatsioon takistab polü A saba lisamist, spetsiaalsed faktorid ei seondu (vale lokalisatsioon, häiritud translatsioon, häiritud transkriptsiooni terminatsioon, eksonukleaaside
vaid saab koheselt suunata translatsioon. Ühelt mRNA-lt on võimalik saada mikroobidelt mitmeid erinevaid valke. Eukarüootides DNA sisaldab eksoneid ja introneid ning saadud mRNA on vaja töödelda, intronid välja lõigata. Poly A 3´saba lisamine ja cap struktuuri lisamine 5´ Cap valgud on algselt seotud polümeraasi sabaga. Ainult täielikult defosforüleeritud RNA polümeraas II on võimeline alustama sünteesi. RNA splaissingu e. kokkupõime põhimõte. Pre-mRNA kokkupõime mehhanism. Splaissosoom RNA alternatiivse kokkupõime tähtsus - mittekodeerivad DNA järjestused välja lõigata, adeniin nukleotiid introni 3´otsas ründabintroni 5´ otsa ja lõikab sealt mRNA katki. snRNAd moodustavad kompleksi valkudega mille tagajärjelt tekivad väikesed tuuma ribonukleovalgud (snRNP),mis viivad splaissingu läbi. BBP(branchpoint binding protein)hargemispunkti valk- tunneb introni keeru koha ära (lasso tekitamise koha)
13. Mis on kanalivalkude reguleerituse põhjusteks? Membraani potentsiaali muutumine, seostumine mitmete keemiliste ühenditega 14. Nimeta kaks protsessi, kus produtseeritakse ATPd Fotosüntees, hingamine 15. Mis on rakutsükkel? Ulatuslik DNA lahti- ja kokkupakkimine 16. Mis on C-väärtus? DNA hulk haploidses eukarüootses kromosoomis (~107-1011 bp) 17. Mida tähendab geenide segmenteeritus? Eksonite (transkribeeritakse RNA kujule) ja intronite (lõigatakse splaissingu tulemusel välja) olemasolu. 18. Mis on transposonid? DNA segmendid, mis võivad genoomis liikuda ühest piirkonnast teise 19. Kuidas jaotatakse mitteviiruslikud transposonid? · LINE elemendid ei ekspresseeru (pseudogeenid), ~15% genoomist · SINE elemendid geenirikastes piirkondades, ~13% genoomist 20. Mis käivitab rakujagunemise kontrollsüsteemi? DNA kahjustus 21. Millised protsessid toimuvad tuumakeses? · rRNA süntees ja protsessimine
sünteesil). RNA korrektsiooni juhib giid-RNA. 120. Intronid ja eksonid. Geeni splaising. Geenidest lõigatakse välja intronid (mittekodeerivad järjestused , mis on esindatud DNA-s, aga mitte mRNAs) ja järeljäävad eksonid (mRNAs esindatud geeni ala; kodeerivad järjestused) ühendatakse geeni splaissingul. Tavaliselt fosforsidemeid üle kandes. DMD - 78 intronit, kana kollageen - vähemalt 50. Introneid lõigatakse välja: tRNA prekursoritest splaissingu endonukleaasiga + ligeerimine (fosfodiesteraasne, kinaasne, ligaasne aktiivsus) rRNA prekursoritest autokatalüütiliselt. pre-mRNA transkriptidest kaheetapiliselt splaissosoomide abil. 121. Autokatalüütiline splaising. Puudub trans; on ainult cis katalüütiline aktiivsus. Reaktsioon vajab guaniini vaba 3'-OH gruppi kui kofaktorit! Intron kõrvaldatakse kahe fosforsideme ülekandega. Väljalõigatud intron võib muuta ringikujuliseks teise fosforsidemete ülekandega. rRNA prekursorid. 122
reguleerimise ning raku vastusega viiruse sissetungile o Leiti PML’I tekitava muteerunud geeni kodeeritud valgu vastase antikeha abil, mis PML kehadega seostub Cajal’i kehad – täpne funktsioon pole teada; o Sisaldavad splaissosoomide snRNPd, snoRNAd, mitmeid RNA töötlusega seotud faktoreid (transkriptsioonifaktorid) o võivad osaleda snRNP-de ja snoRNA-de küpsemises ja transpordis; toimub pre-mRNA splaissingu jaoks vajalike komplekside taasmoodustumine; o ülesanne on tuua erinevad makromolekulid kiiresti kokku, et tõsta nende kontsentratsiooni ning omavahelise seostumise tõenäosust o Cajal-i kehade olemasolu on eriti vajalik tihti jagunevates rakkudes (tüvirakud, embrüonaalsed neuronid, kasvajarakud) PcG (polycomb) keha – osalevad Drosophila rakkude tuumades Polycomb- valkude vahendatud geenipaardumises ja vaigistamises ning asuvad tihti
60. Võrrelge eukarüootsete ja prokarüootsete geenide struktuuri. Eukarüootse RNA transkriptsioonijärgne modifikatsioon. Eukarüoodil eksonite (kodeerivad alad) vahel on mittekodeerivad alad (intronid). Peale transkriptsiooni lõigatakse tuumas intronid välja ning viiakse eksonitega RNA tsütoplasmasse (splaissing). Prokarüoodil geenid on koos, transkripteeritakse korraga - operon 61. Intronite kõrvaldamine splaissingu teel. Alternatiivne splaissing lõigatakse välja ka osa eksoneid, tekivad erinevate osadega valgud · tRNA prekursorite puhul teeb katked RNA ahelasse splaissingu endonukleaas ja eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil · osade rRNA prekursorite puhul kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt · rakutuumas asuvate pre-mRNA molekulide splaissing toimub kaheetapiliselt ribonukleoproteiin-partiklites splaissoomides
initsiatsioon prokarüootsetelt promootoritelt; transkriptsiooni elongatsioon; transkriptsiooni terminatsioon. Transkriptsioon eukarüootidel: RNA polümeraasid eukarüoodi rakus; transkriptsiooni initsiatsioon eukarüootsetelt promootoritelt; RNA ahela elongatsion; transkriptsiooni terminatsioon. Eukarüootsete geenide struktuur: eksonid ja intronid; intronite kõrvaldamine splaissingu teel. mRNA molekulis asuva geneetilise informatsiooni muutmine RNA editing. 13. Translatsioon ja geneetiline kood. Polüpeptiidide struktuur. Translatsioon: ribosoomide ehitus; koodonid ja antikoodonid; tRNA molekulid; tRNA laadimine aminohappega; tRNA seondumise saidid ribosoomis. Translatsiooni protsessi erinevad etapid võrdlevalt prokarüootides ja eukarüootides: initsiatsioon; elongatsioon ja terminatsioon. Geneetiline kood ja selle omadused
Eukarüootse RNA transkriptsioonijärgne modifikatsioon. Eukarüoodis: enamasti paiknevad kodeerivate alade – eksonite – vahel mittekodeerivad alad – intronid (geenijärjestused, mis jäävad mRNA koostisesse pärast splaissingut). Intronite sisaldus ja pikkus varieerub geeniti. Intronite pikkus võib varieeruda 50st nukleotiidist tuhandeteni. Prokarüootidel puuduvad intronid ja histoonid. 61. Intronite kõrvaldamine splaissingu teel. Intronite väljalõikamine võib toimuda kolme erineva mehhanismi alusel: 1) tRNA prekursorite puhul teeb katkeid RNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ning eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. 2) Osade rRNA prekursorite ouhul kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt RNA molekuli enda poolt. Reaktsioon ei vaja välist energiaallikat ega valkude aktiivsust. 3) Rakutuumas asuvate pre-mRNA
57. Mille poolest erineb transkriptsioni initsiatsioon replikatsiooni initsiatsioonist? 58. Võrrelge prokarüootset ja eukarüootset transkriptsiooni initsiatsiooni. 59. Transkriptsiooni elongatsioon ja terminatsioon. 60. Võrrelge eukarüootsete ja prokarüootsete geenide struktuuri. Eukarüootse RNA transkriptsioonijärgne modifikatsioon. 61. Intronite kõrvaldamine splaissingu teel. 62. mRNA molekulis asuva geneetilise informatsiooni muutmine RNA editing. 63. Transkriptsiooni ja translatsiooni toimumise aeg ja koht bakterites ja eukarüootides. Bakterites samaaegselt ja ühes kohas, Eukarüoodil transkriptsioon tuumas, translatsioon hiljem tsütoplasmas. 64. Ribosoomide ehitus prokarüootses ja eukarüootses rakus. Prokarüootides 3-5 subühikust ja üle 50 erinevast ribosoomivalgust.
primaarne transkript üldjuhul ka koheselt transleeritav. Eukarüootses rakus toimub aga primaarse transkripti, pre-RNA, protsessimine transleeritavaks mRNA molekuliks. Enamus eukarüootseid geene rakutuumas sisaldavad endis mittekodeerivaid alasid introneid, mis vahelduvad kodeerivate piirkondadega eksonitega. Intronjärjestusi sisaldavatelt geenidelt sünteesitakse transkriptsiooni käigus pre-mRNA, millest seejärel kõrvaldatakse mittekodeerivad järjestused splaissingu (splicing) teel. Slaissingureaktsiooni läbiviimiseks moodustub makromolekulaarne struktuur, mida nimetatakse splaissosoomiks. Enne splaissimist lisatakse pre-mRNA-le 5´-otsa 7-metüülguanosiin ja 3´- otsa polü-A järjestus polüA saba, mis on 20-200 nukleotiidi pikk. Kõik need protsessid toimuvad rakutuumas. Protsessitud mRNA transporditakse tsütoplasmasse ning alles seal toimub translatsioon. Erinevalt eukarüootidest, kus
Promootor – DNA järjestus, millelt algab transkriptsioon. Terminaator – DNA järjestus, mille juures lõppeb transkriptsioon mRNA transkriptsiooni etapid: 1. Ensüüm RNA polümeraas liitub DNA molekuliga ning keerab selle lahti. 2. Ensüüm RNA-polümeraas sünteesib DNA lõigust komplementaarse RNA molekuli. a. preRNA, mis koosneb eksonitest ja intronitest b. splaissingu teel lõigatakse intronid välja, jäävad ainult eksonid c. Eksonitest moodustub küps RNA 3. Ensüüm RNA-polümeraas jõuab terminaatorpiirkonda. 4. DNA ahel suletakse ensüümide abil. 5. Geeni kopeerimisel valmib mRNA, mis viiakse rakutuumast välja ribosoomidesse. (lisaks võib luua ka tRNAd ja rRNAd) NB! Toimub rakutuumas, tuumapiirkonnas, mitokondrites ja kloroplastides. 27. mRNA erinevused prokaüootidel ja eukarüootidel
- kodeeriv ala eukarüootidel koosneb eksonitest (kodeeriv ala, mis on küpse RNA koostises) ja intronitest (transkribeeritav ala, mis lõigatakse RNA-st välja), vt skeemi vihikust. Genoom- ühes liigiomases kromosoomikomplektis sisalduv geneetiline materjal ehk sisuliselt siis DNA. Inimese genoom koosneb 24 kromosoomist. 3,2 miljardit nukletiidi, HIVil 10 000 nt 26. Transkriptsioon Kõigepealt on seal preRNA, mis koosneb eksonitest ja intronitest, siis splaissingu teel (lõigatakse välja) saadakse ainult eksonid, millest moodustub küps RNA, mille järgi saab valgu. Transkriptsioon- matriitssüntees, mille käigus saadakse DNA molekuli ühe ahela nukleotiidse järjestusega komplementaarne RNA molekul. Kui geenilt toimub transkriptsioon, nim seda geeni avaldumiseks. Avaldumise järgi jaotatakse geenid 4 gruppi: 1)Samaaegselt kõigis rakkudes avalduvad geenid- rRNA, tRNA. 2)Kindla koe rakkudes avalduvad geenid- insuliini geen kõhunäärmerakk udes
- kodeeriv ala eukarüootidel koosneb eksonitest (kodeeriv ala, mis on küpse RNA koostises) ja intronitest (transkribeeritav ala, mis lõigatakse RNA-st välja), vt skeemi vihikust. Genoom- ühes liigiomases kromosoomikomplektis sisalduv geneetiline materjal ehk sisuliselt siis DNA. Inimese genoom koosneb 24 kromosoomist. 3,2 miljardit nukletiidi, HIVil 10 000 nt 26. Transkriptsioon Kõigepealt on seal preRNA, mis koosneb eksonitest ja intronitest, siis splaissingu teel (lõigatakse välja) saadakse ainult eksonid, millest moodustub küps RNA, mille järgi saab valgu. Transkriptsioon- matriitssüntees, mille käigus saadakse DNA molekuli ühe ahela nukleotiidse järjestusega komplementaarne RNA molekul. Kui geenilt toimub transkriptsioon, nim seda geeni avaldumiseks. Avaldumise järgi jaotatakse geenid 4 gruppi: 1)Samaaegselt kõigis rakkudes avalduvad geenid- rRNA, tRNA. 2)Kindla koe rakkudes avalduvad geenid- insuliini geen kõhunäärmerakk udes
Geeni RNAd kodeerivale alale eelneb vahetult piirkond, kuhu kinnitub RNA polümeraas ning seda piirkonda nimetatakse promootoriks. Geeni koosseisu arvatud regulaatorpiirkonnad võivad RNA-d kodeerivast osast (vähemalt eukarüootides päris kaugel paikneda – kuni 50 000 aluspaari) RNA transkriptsioon lõpeb piirkonnas, mida nimetatakse terminaatoriks. Mida mõeldakse eukarüoodi geenide segmenteerituse all ning mis toimub splaissingu käigus? Geenide segmenteeritus tähendab eksonite ja intronite olemasolu. Eksonid (i.k - expressed sequences) on piirkonnad DNAs ja RNAs, milles olev info jõuab valgu kujule, ja intronid (i.k - intervening sequences) lõigatakse splaissingu käigus RNA molekulist välja. Milliseid ülesandeid võib täita rakus RNA (mRNA-d mitte arvestades)? Nimetage selle kursuse raames käsitletud funktsioone/organelle/ensüümikomplekse, kus RNA on osaline.
2. PolyA saba 3’ otsas. Sinna seonduvad valgud mid aitavad vältida otste ladungamist ja osalevad mRNA transpordil tsütoplasmasse. 3. RNA splaissing. Pre-mRNA sisaldab nii introneid kui eksoneid. Intronid eemaldatakse. Splaissingus osaleb üle 200 erineva valgu, mis moodustavad splaissoomi. mRNA splaissimine on mitmeetapiline protsess. Splaissoomid: tuvastavad eksonite piirid, katalüüsivad introni välja lõikamist. 61. Intronite kõrvaldamine splaissingu teel. Selleks, et splaissitud mRNA kodeeriks funktsionaalset valku, peab splaissingu protsess toimuma väga täpselt. Intronite väljalõikamine võib toimuda kolme erineva mehhanismi alusel: 1. tRNA prekursorite puhul teeb katked RNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ning eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. 2. Osade rRNA prekursorite puhul (paljudes madalamates eukaüootides, samuti ka rakuorganellides)
60. Võrrelge eukarüootsete ja prokarüootsete geenide struktuuri. Eukarüootse RNA transkriptsioonijärgne modifikatsioon. · Eukarüoodi DNAs on kodeerivad alad eksonid ja neid killustavad mittekodeerivad alad intronid, prokarüoodis on aga kõik geenid koos operonides ja transkribeeritakse korraga. · Peale transkriptsiooni lõigatakse eukarüootses rakus pre-mRNA-st intronid välja ning tuumast väljuvad vaid eksonid. 61. Intronite kõrvaldamine splaissingu teel. · 3 erinevat mehhanismi: tRNA prekursorite puhul teeb katked RNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ja eksoneid sisaldavad RNA fragmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. Need molekulid tunnevad spetsiifiliselt ära RNA prekursormolekuli kõrgemat järku struktuuri, mitte aga nukleotiidset järjestust Osade rRNA prekursorite puhul toimub splaissing autokatalüütiliselt RNA molekuli
printsiibil; mitteseostunud molekulid eemaldatakse. Detekteeritakse ja analüüsitakse (autoradiogramm). Nõuab suurt RNA kogust, nõuab vigastamat RNA, madal tundlikkus, aga ainuke meetod, mis annab info nii suuruse kui ka koguse kohta (Kasulik: transkripti splaissingu variantide võrdlemisel eri kudedes). Rnase protection: Kasutatakse mRNA hulga mõõtmiseks ja selle kaardistamiseks. Ei nõua ainult vigastamata RNA, 20-100 korda tundlikum, kui eelmine meetod. Quantitative RT-PCR: Väga tundlik meetod, RNA peab olema puhastamata. Transkriptsiooni koha määramiseks võib kasutada: Nuclease S1 või primer extension. Ekson-intron piire kaardistatakse Nuclease C1 abil. 23
intronid. Geeni RNAd kodeerivale alale eelneb vahetult piirkond, kuhu kinnitub RNA polümeraas ning seda piirkonda nimetatakse promootoriks. Geeni koosseisu arvatud regulaatorpiirkonnad võivad RNA-d kodeerivast osast (vähemalt eukarüootides päris kaugel paikneda kuni 50 000 aluspaari) RNA transkriptsioon lõpeb piirkonnas, mida nimetatakse terminaatoriks. 32. Mida mõeldakse eukarüoodi geenide segmenteerituse all ning mis toimub splaissingu käigus? Geenide segmenteeritus tähendab eksonite ja intronite olemasolu. Eksonid (i.k - expressed sequences) on piirkonnad DNAs ja RNAs, milles olev info jõuab valgu kujule, ja intronid (i.k - intervening sequences) lõigatakse splaissingu käigus RNA molekulist välja. 33. Milliseid ülesandeid võib täita rakus RNA (mRNA-d mitte arvestades)? Nimetage selle kursuse raames käsitletud funktsioone/organelle/ensüümikomplekse, kus RNA on osaline.
kõrvaldamine (geeni splaissing) Eukarüootide tuumas toimub mRNA modifikatsioon (protsessing): 5´- otsa 7-metüülguanosiin-(MG)-mütsi ja 3´-otsa polü(A)-saba lisamine. Eukarüootide mRNA transporditakse tuumast tsütoplasmasse. o Modifikatsioonid DNA metülatsioon Histoonide atsetülatsioon o Valgusünteesi komponendid eukarüoodil. Transkriptsioonilised RNA-d: mRNA, miRNA, rRNA, snRNA, tRNA. snRNA splaissingu funktsioon splaissosoomis. mRNA, rRNA, tRNA ribosoomide ja aminohapete osalus translatsioonil tsütoplasmas. miRNA regulatiivne funktsioon: Drosha on ensüüm, mis lõikab tuumas pre-miRNA-st välja kaksikahelalised RNA osad; Dicer on nukleaas, mis trimmib pre-miRNA-st miRNA; RICS on RNA indutseeritud translatsiooni vaigistav kompleks. Geeni struktuur
kaudu. Teatud rakk sünteesib morfogeeni (informatsioonisignaal), mida transporditakse naaberrakkudeni, kus nende pinnal tänu ühinemisele signaalretseptoriga aktiveeritakse signaali ülekandeahel, mille toimel omakorda indutseeritakse raku tuumades transkriptsioonifaktorite süntees. 10. Sugu määravad geenid Soo määramise regulatsioon Drosophila´l suguletaalse (Sex-lethal e. Sxl-) geeni poolt. SXL-valk on splaissingu regulaator, mis kontrollib nii tema enda geenilt sünteesitud RNA splaissingut kui ka transformergeenilt (tra) sünteesitud RNA splaissingut. TRA-valk kontrollib koos transformergeeni 2 (transformer2 e. tra2) valguga TRA2 ka autosoomse kahesoolisuse geeni (doublesex e. dsx) splaissingut, sest TRA-valgu olemasolul splaissitakse dsx-transkript nii, et sellelt transleeritud DSX-valk pärsib isaste sootunnuste arengut.
Genoomi suurus ei määra organismi keerukustaset. 31. Kirjeldage geeni ehitust. Geen on DNA lõik, mis transkripteeritakse ühe üksusena ja kannab infot ühe valgu kohta. Geeni hulka loetakse ka intronid ja transkriptsiooni regulaatorpiirkonnad. Promootorpiirkond, kuhu seondub RNA polümeraas transkriptsiooni algatamisel ja terminaatorpiirkond mis lõpetab transkriptsiooni. 32. Mida mõeldakse eukarüoodi geenide segmenteerituse all ning mis toimub splaissingu käigus? Segmenteerituse all mõeldakse seda, et DNAs on intronid ja eksonid, eksonite geneetiline materjal jõuab valgu kujule, intronid lõigatakse RNAst splaissingu käigus välja. 33. Milliseid ülesandeid võib täita rakus RNA (mRNA-d mitte arvestades)? Nimetage selle kursuse raames käsitletud funktsioone/organelle/ensüümikomplekse, kus RNA on osaline. RNA aitab moodustada sekundaarstruktuure, transportida valke ER-i, osalevad X
mRNA kodeerib kuni 3 valku. RNA polümeraas seostub otse DNA- le, pole vaja transkriptsiooni initsiatsiooni faktoreid. Eukarüdoodis- Vajab transkriptsiooni initsiatsiooniks cis- aktiveerivate elementide ja trans- aktiveerivate faktorite (regulatoorsed valgud) KOOSTOIMET. ei toimu samaaegselt, transkr-tuumas, transla- tsütoplasmas. Start koodon AUG, kuid ei kasuta formüül-metioniini. Eukarüootne mRNA kodeerib ühte valku. Eu, DNA sisaldab introneid, mis lõigatakse splaissingu käigus välja 5. Geneetiline kood (põhimõte, muutlikkus) mRNA nukleotiidide tripleti vastavus aminohappele valgu molekulis, üks triplett vastav ühele aminohappele. Ühele aminohappele mitu erinevat tripletit. Täielik kõdumine- kolmandas positsioonis on suvaline nukleotiid, mis ei muuda aminohapet Osaline kõdumine- muudab keemilisete omaduste poolest lähedase aminohappe tootmine. 6. Translatsioon, peptiidside, valkude struktuurid
transportvalkudega (hn RNP heterogeennne ribonukleoproteiin) on näha TEM fotodel (11-29 lk428,11-30 lk 429) liikumas läbi tuuma pooride ja seejuures lahti keerdumas. Tsütoplasmas mRNA seostub ribosoomidega ja algab valgu süntees. Valkude transport tsütoplasmast tuuma Tuuma struktuuri formeerumiseks ja tuumas toimuvate protsesside läbiviimiseks on vajalikud teatud valgud lamiinide koostises olevad, histoonid, DNA ja RNA polümeraasid, DNA replikatsiooni ja transkriptsiooni faktorid, splaissingu valgud, hn NPR kuuluvad valgud, ribosoomide valgud, valgud mis liiguvad tsütoplasma ja tuuma vahel (eksportiin1, Ran jne). Intensiivse DNA sünteesi ajal igas minutis peab iga tuuma poori läbima ~100 histooni molekuli. Tuumast tsütoplasmasse peab minutis liikuma ~6 suurt ja väikest ribosoomi subühikut. Tsütoplasmas ribosoomidel sünteesitud valkudest liiguvad tuuma sellised valgud, mis sisaldavad nukleaarse lokalisatsiooni signaali (NLS). NLS struktuur ja tähtsus avastati
neutraalsusest. Paljud sünonüümsed asendused võivad olla neutraalsed, osad aga mitte. Enamus sünonüümseid asendusi pole mitte neutraalsed vaid peaaegu neutraalsed. Kõrvalekaldumisega seotud protsessid: 1. mRNA stabiilsuse optimeerimine – transkript voldib ennast optimaalseimasse konfiguratsiooni ja valik töötab selliste sünonüümsete asenduste vastu, mis seda destabiliseeriksid. 2. Efektiivse splaissingu kontrollimine – sünonüümsed positsioonid võivad olla olulised intronite väljalõikamiskoha defineerimisel. 3. Geeniekspressiooni regulatsioon üle mRNAle seostuvate miRNAde 4. Valkude kokkupakkimise optimeerimine Fülogeneetika Fülogeneesi- e evolutsioonipuud 7. Millega tegeleb fülogeneetika? Tegeleb organismirühmade evolutsioonilise arengukäigu ehk fülogeneesi uurimise ja rekonstrueerimisega. Ehk uutib
koheselt transleeritav. Eukarüootses rakus toimub aga primaarse transkripti,pre-RNA, protsessimine transleeritavaks mRNA molekuliks. Enamus eukarüootseid geene rakutuumas sisaldavad endis mittekodeerivaid alasid introneid, mis vahelduvad kodeerivate piirkondadega eksonitega. Intronjärjestusi sisaldavatelt geenidelt sünteesitakse transkriptsiooni käigus pre-mRNA, millest seejärel kõrvaldatakse mittekodeerivad järjestused splaissingu (splicing) teel. Slaissingureaktsiooni läbiviimiseks moodustub makromolekulaarne struktuur, mida nimetatakse splaissosoomiks. Enne splaissimist lisatakse pre-mRNA-le 5´-otsa 7-metüülguanosiin ja 3´- otsa polü-A järjestus polüA saba, mis on 20-200 nukleotiidi pikk. Kõik need protsessid toimuvad rakutuumas. Protsessitud mRNA transporditakse tsütoplasmasse ning alles seal toimub translatsioon. Erinevalt eukarüootidest, kus
ehk polü-(A)-saba. 7-metüülguanosiinmüts aitab kaitsta kasvavat RNA- ahelat nukleaasidedegradatsiooni eest ning eukarüootide mRNA polü(A)-saba suurendab oluliselt transkripti stabiilsust ja tal on tähtis roll mRNA transportimisel tuumast tsütoplasmasse. Küpses mRNA-s on ka mittekodeerivad piirkonnad (ingl. UTR-untranslated regions) – liider (alguses, 5’ osas), treiler (lõpus, 3’ osas). Splaissingu läbiviimiseks moodustub makromolekulaarne struktuur, mida nimetatakse splaissosoomiks. Kõik nimetatud protsessid toimuvad tuumas. Protsessitud mRNA transporditakse tsütoplasmasse, kus ta transleeritakse. Translatsioon on mRNA- s nukleotiididejärjestusena salvestatud informatsiooni ülekandmine aminohapete järjestuseks sünteesitava valgu molekulis. mRNA nukleotiididetriplettide vastavust aminohapetele valgu molekulis nimetatakse geneetiliseks koodiks.
Genoomi suurus ei määra organismi keerukustaset. 31. Kirjeldage geeni ehitust. Geen on DNA lõik, mis transkripteeritakse ühe üksusena ja kannab infot ühe valgu kohta. Geeni hulka loetakse ka intronid ja transkriptsiooni regulaatorpiirkonnad. Promootorpiirkond, kuhu seondub RNA polümeraas transkriptsiooni algatamisel ja terminaatorpiirkond mis lõpetab transkriptsiooni. 32. Mida mõeldakse eukarüoodi geenide segmenteerituse all ning mis toimub splaissingu käigus? Segmenteerituse all mõeldakse seda, et DNAs on intronid ja eksonid, eksonite geneetiline materjal jõuab valgu kujule, intronid lõigatakse RNAst splaissingu käigus välja. 33. Milliseid ülesandeid võib täita rakus RNA (mRNA-d mitte arvestades)? Nimetage selle kursuse raames käsitletud funktsioone/organelle/ensüümikomplekse, kus RNA on osaline. RNA aitab moodustada sekundaarstruktuure, transportida valke ER-i, osalevad X
koheselt transleeritav. Eukarüootses rakus toimub aga primaarse transkripti,pre-RNA, protsessimine transleeritavaks mRNA molekuliks. Enamus eukarüootseid geene rakutuumas sisaldavad endis mittekodeerivaid alasid introneid, mis vahelduvad kodeerivate piirkondadega eksonitega. Intronjärjestusi sisaldavatelt geenidelt sünteesitakse transkriptsiooni käigus pre-mRNA, millest seejärel kõrvaldatakse mittekodeerivad järjestused splaissingu (splicing) teel. Slaissingureaktsiooni läbiviimiseks moodustub makromolekulaarne struktuur, mida nimetatakse splaissosoomiks. Enne splaissimist lisatakse pre-mRNA-le 5´-otsa 7-metüülguanosiin ja 3´- otsa polü-A järjestus polüA saba, mis on 20-200 nukleotiidi pikk. Kõik need protsessid toimuvad rakutuumas. Protsessitud mRNA transporditakse tsütoplasmasse ning alles seal toimub translatsioon. Erinevalt eukarüootidest, kus
ei satu kogu DNA kodeeriv osa produkti. Prokarüootide geenid on tavaliselt pidevad, DNA järjestuse struktuurne osa paikneb pideva järjestusena ja kopeeritakse produkti. Prokarüootsed geenid on enamasti organiseeritud operonidesse, milles on mitut produkti kodeerivad järjestused ühise regulaatori kontrolli all. Eukarüootide geenid on enamasti katkendlikud, sisaldavad introne ja eksone. Geeni primaarne produkt mRNA, läbib splaissingu, mille käigus osa RNA järjestusest eemaldatakse. Intronid eemaldatakse. Eksonid jäävad alles ja nende ühendamise (splaissingu) tulemusel tekib küps mRNA. (Inton-ekson skeem) Ka küpses mRNA's on mittekodeerivad järjestused, nn liider ja treiler vastavalt mRNA alguses (5' osas) ja lõpus (3' osas). Ka ühe geeni intronid võivad kodeerida produkte, nn. intron kodeeritud produktid. Siia kuuluvad mitmed väikesed RNA molekulid (snoRNA).
Osalevad DNA ja RNA, valkude metabolismis. Intron - ekson struktuur 5’ ex 1 ― int 1 ― ex 2 ― int 2 ― ex 3 3’ - iga premRNA transkriptsoon algab ja lõpeb eksoniga, intronid on vahepeal. - splassingu komponendid seotud Polümeraas II karboksüterminaalse domääniga Erinevad RNA splaissimistüübid - splaissosoomi (RNA + valk, katalüüsib intronite eemaldamist) suunatud splaissimine - esimene reaktsioon toimub splassingukompleksiga. 5’ splaissingu saiti tekib cycl. Vaheühend, vabaneb 5’ eksoni 3’ ots, mis atakeerib 3’ splaissi, vabaneb intron, mis on seotud splassingu kompleksiga ja ekson. - isesplaissuvaid introneid (ei vaja lisakomponente, kui siis Mg ja ühevalentseid katioone, ribosüümid) on 2 tüüpi: 1) Tüüp II – sarnane premRNA splaissimisele, kuid ei kasuta välispidiseid faktoreid 2) Tüüp I – erinevad teistest, kuna kasutavad G-nukleotiidi kofaktoreid. G-nukleotiidi
vähirakkude puhul on kõvasti. Saab kiiresti täielikult ülevaatliku pildi situatsioonist. m-FISH: tulemus umbes sama, mis SKY'l, muidu natuke erinev (näiteks eksitatsioon). Tehakse spektraalanalüüs. 3D-FISH: Interfaasi rakus on kromatiin lahti pakitud ja aktiivne, aga kromosoomide asukoht ei ole suvaline. Kromosoomide territooriumid näeb ära konfokaalmikroskoopiaga funktsioneerivas intaktses tuumas: reaalajas transkriptsiooni, splaissingu jm vaatamine. 7. Võrdlev genoomne hübridisatsioon ... on molekulaar-tsütogeneetiline meetod, mis uurib geenikoopiate numbri muutusi kasvajarakkudes. Meetod baseerub fluorestseeruvalt värvitud tuumori ja punaselt värvitd (rhodamiin) normaalse DNA võrdluses. Meetod detekteerib vaid mittebalanseeritud muutusi. Erinevalt värvitud DNA'd segatakse, lisatakse cot-1 DNA'd (et alla suruda korduvaid DNA järjestusi). Segu hübridiseeritakse normaalsete metafaasi kromosoomidega. Värvingust on
mittefunktsionaalseks ehkki neilt transkribeeritakse RNAd. Teine võimalus pseudogeenide tekkeks on RNA pöördtranskriptsioon cDNAks ja viimase integratsioon genoomi intron-vaba DNAna. 8. Missugused molekulaarsed mehanismid tagavad selle, et inimese genoomi 30,000-40,000 geeni kodeerivad 100,000 ndeid erinevaid valke? Alternatiivne splaissing kui tava-arusaama järgi kleebitakse küpse RNA saamiseks eksonid lihtsalt kokku, siis alternatiivse splaissingu käigus kasutab rakk erinevaid eksonite kombinatsioone, et teha erinevaid küpseid mRNA-sid ja valke. Alternatiivne splaising võib toimuda samas raku tüübis vastuseks erinevatele keskkonna-ja raku arengut määravatele signaalidele. Post-translatoorsete modifikatsioonidega saab anda osadele valkudele erinevaid funktsioone (nii, et need näivad erinevate valkudena). 9. Missugusi geneetilise info vahetuse protsesse tähistavad a) transformatsioon, 2) transkriptsioon 3) translatsioon.
Makromolekulid kui info allikad fülogeneetilistele, konstruktidele ja rekonstruktsioonidele Viimased kümmekond aastat on kiiresti arenenud molekulaarsete tunnuste kasutamine fülogeneetilistes rekonstruktsioonideks. Võib koguni öelda, et geenide ja valkude primaarstruktuuri andmestik on muutunud absoluutselt domineerivaks. Eelkõige just andmestik geenide tasemel, sest valkude primaarstruktuuri selgitamine on valdavalt tuletis geeni struktuurist - teades geneetilist koodi (ja splaissingu reegleid seal, kus on tegemist intronitega). Mis siis tingis sellise pöörde? Palju asjaolusid. Esiteks muidugi meetodite kättesaadavus, õigemini nende avastamine (loomine): geenide sekveneerimine, kloneerimine ja amplifitseerimine. Kuidas suhtuvad omavahel klassikalised morfoloogilised meetodid ja molekulaarsed? Mingil metatasemel ei ole vahet, kuid prakrtilised erinevused on arvukad ja üsna suured.
aminohapet ja teda nimetatakse ühendavaks (joining) või J- geeni segmendiks (inimesel 5). V ja J geeni segmendi ühinedes luuakse pidev ekson, mis kodeerib terve kerge ahela V regiooni. V- segment asub kaugel C regioonist, aga J -segment on lähedal C regioonile. Kui V-ja J-segmendid ühinevad, toob see ka V- segmendi C-regiooni lähedale. Et teha terve Ig kerge ahela mRNAd, tuleb V- regiooni eksonil ühineda C-regiooni järjestusega RNA splaissingu abil peale transkriptsiooni. Immunoglobuliini ahelad on ekstratsellulaarsed proteiinid ja V-geeni segmendile eelneb ekson, mis kodeerib juhtpeptiidi ja juhatab proteiini raku sekretoorsetesse käikudesse. C-regiooni kerged ahelad on kodeeritud erinevate eksonite poolt ja ühendatud V-regiooni eksoniga. Raske ahel: Raske ahela V-regioon on kodeeritud 3 geenisegmendi poolt: V (inimesel 51), J (inimesel 6) ja DH (diversity) (inimesel 27)
annaabi.ee 
