Värvusetu Värviline Lisaks nimetatud orgaanilistele ühenditele võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuviljad vm taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(II). Katse käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis
Kindlasti ei teinud te apelsinimahla uurides 25-kordset lahjendust, vaid 250-kordse. Tehke lõpparvutus 250-kordse lahjendusega. Ja kindlasti leidke kirjandusest internetist andmed, millega oma tulemust võrrelda. 08.06.15. M.Kreen 3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Protokoll on koostatud väga lohakalt. Isegi see pole selge, kas uurisite sidruni või apelsinimahla Palun koostage protokoll oma jõududega, ärge laske end eeskujudest eksitada 22.05. M. Kreen Liina Reimann 134537KATB Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi
Värvusetu Värviline Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 reedutseerimine H2O-ks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6], ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH=6 juures. Peroksüdaas 2+ 2 Fe + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Töö käik: Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme GOx ja POx, kromogeenset substraadi K4[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Tundmatu proovi ettevalmistamine Sidruni mahl 50ml katseklaasi valan 1ml filtreeritud sidruni mahla ja lahjendan x50 korda destilleeritud veega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Selleks, et glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlaks teha, tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel =410 nm. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (= optilise tiheduse) väärtust nimetatud lainepikkusel.
Glükoosi kontsentratsiooni teada saamiseks tundmatus proovis tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) ehk optilise tihedusega (D) lainepikkusel 410 nm. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (= optiline tihedus) väärtust nimetatud lainepikkusel. Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtusin glükoosi standard- lahusest, mille glükoosisisaldus oli täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust, mille kontsentratsioonid olid 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Esimese lahuse valmistamiseks võtsin 2,5 ml standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vett. Teise lahuse valmistamiseks võtsin esimesest lahusest 5 ml ja lisasin sellele 5 ml vett. Kolmas lahus valmis analoogselt teisele. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsiooni viisin läbi toatemperatuuril. Võtsin 6 puhast ja kuiva katseklaasi ning
destilleeritud vett c) Kolmandasse katseklaasi võtsin 5 ml teisest katseklaasist ja lisasin 5 ml destilleeritud vett 11. Sain glükoosi standardlahusest kolm lahjendust kontsentratsioonidega: a) 0,25 mg/ml b) 0,125 mg/ml c) 0,062 mg/ml 12. Panen statiivi 6 kuiva ja puhast katseklaasi. Tähistasin need: 1, 2a, 2b, 3, 4, 5 NULLPROOV näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni Katseklaas Sooritatud tegevus KATSEKLAAS 1 (NULLPROOV!) Pipeteerisin 1 ml destileeritud vett + 3 ml tööreaktiivi + loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks KATSEKLAAS 2a (PARALLEELPROOV!) Pipeteerisin 1 ml uuritavat lahust + 3 ml tööreaktiivi + loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks
lahjendusmäära osas: tuli võtta 1ml sidrunimahla 25 ml lahuse jaoks. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks sidrunimahlas tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni (x telg) lahuse optilise tihedusega (y telg) lainepikkusel 410 nm. Glükoosilahuste valmistamisel lähtusime glükoosi standardlahusest, mille glükoosisisaldus on 1,0 mg/ml. Esmalt tuli sellest valmistada kindel maht (10ml) glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml, seejärel tuli seda lahjendada 2 korda ning saadud lahjendust omakorda 2 korda. Värvusreaktsiooni läbiviimine Vaja läheb 6 puhast ja kuiva katseklaasi, katse toimub toatemperatuuril. Katseklaas nr 1 pipeteerida 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov) Katseklaas nr 2 ja 3 pipeteerida 1 ml uuritavat lahust (2 paralleelproovi)
Analüütilistel kaaludel kaalutakse 0,1 kuni 0,2 g mett ja viiakse kadudeta 100 ml mõõtekolbi. Selleks loputatakse 2-3 korda kuuma destilleritud veega kaaluklaasi ja viiakse vedelik lehtri abil samasse mõõtekolbi. Kolb täidetakse destilleeritud veega kuni kaelal oleva märgini, suletakse korgiga ja loksutatakse hoolega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi konsentratsiooni kindlakstegemiseks tuleb koostada kaliibrimisgraafik, mis ühendab endas glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel =410 nm. X-teljel on glükoosi konsetratsioon, y-teljel absorptsiooni väärtus. Glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standardlahusest, milles on glükoosi 1,0 mg/ml. Lahjenduste konsentratsioonid: 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Kasutasin sammsammult lahjendamist. Selleks valmistatakse esmalt standardlahusest kindel maht (meie näites 10 ml)
on detekteeritav lainepikkusel 639 nm. Mugavaks substraadiks vaadeldava reaktsiooni jaoks on kaaliumheksatsüano-ferraat (II) K4(Fe(CN)6) ehk kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe 3+- ks. Sellega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks, tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. See reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Selles töös kasutataksegi POD substraadina kaaliumheksatsüanoferraat(II). 3 Töö käik Töö eesmärgiks on glükoosisisalduse määramine tundmatus proovis. Selleks kasutatakse tööreaktiivi, mis sisaldab eelpoolnimetatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD), kromatogeenset, st reaktsiooni käigus värviliseks muutuvat substraati
.......................................... 5 Meloni lahuse ettevalmistamine.......................................................................5 Glükoosilahuste valmistamine..........................................................................5 Värvusreaktsiooni läbiviimine...........................................................................6 Katse andmed..................................................................................................... 7 Kaliibrimisgraafik................................................................................................. 7 Arvutused............................................................................................................ 7 Järeldused............................................................................................................... 8 Kasutatud kirjandus................................................................................................ 9 Sissejuhatus Laboratoorse töö 3
Standardlahusest valmistatakse kolm lahjendust: 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Antud töös kasutasin samm-sammulist lahjendamist. Selleks valmistasin esmalt standardlahusest 10 ml glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml, mida seejärel lahjendasin 2 korda ning saadud teist lahjendust omakorda 2 korda. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. Selleks asetatakse katseklaaside statiivi 6 puhast ja kuiva katseklaas, nummerdatakse. Kontrollkatse ehk 0-proov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni, viiakse läbi destveega. Uuritava lahusega tehakse 2 paralleelkatset, glükoosi standardlahusest valmistatud lahjendustega igaühega 1 katse. Katseklaasidesse pipeteeritakse 1 ml lahust ning 3 ml tööreaktiivi ning loksutatakse ühtlase kontsentratsiooni saavutamiseks. Fikseeritakse reaktsiooni algusaeg ning hoitakse 20 minutit toatemperatuuril. Lainepikkusel 410 nm
Kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate nagu näiteks diaminobensidiin, tetrametüülbensidiin, samuti 2-tolidiin jt. Antud töös kasutatakse substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II) (K 4[Fe(CN)6]) ehk kollast veresoola. POx katalüüsib raud(II) raud(III)-ks ja vesinikperoksiid redutseerub veeks. Kaaliumheksatsüanoferraat(III) (K3[Fe(CN)6]) ehk punane veresool anna lahusele kollase värvuse, mis on dekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik Tööreaktiiv on eelnevalt juba valmis tehtud, seega alustan tööd uuritava lahuse ettevalmistamisest. Kuna minu valitud uuritav aine on õunamahl, siis juhendaja näpunäidete järgi teen sellest 100-kordse lahjenduse. Selleks võtan 1 ml mahla ja pipeteerin selle 100 ml mõõtkolbi ning kolvi destilleeritud veega kuni märgini. Segan lahuse korralikult läbi. Et glükoosi kontsentratsiooni proovis kindlaks teha, tuleb koostada kaliibrimisgraafik
sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt. O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Võib kasutada ka kaaliumheksatsüanoferraati(II), mis oksüdeerudes annab lahusele kollase värvuse (Fe2+Fe3+) ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik Eelnevalt valmistatakse tööreaktiiv (25 ml): · 2,5 mg glükoosi oksüdaasi · 1,5 mg peroksüdaasi · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0 · K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni Uuritava lahuse ettevalmistamine · Prooviks kasutatakse pressitud apelsinimahla · Lahuseks võetakse 0,5 ml mahla, pipeteeritakse see 200ml mõõtekolbi ja täidetakse
värviline Mugavaks substraadiks, mida siin töös kasutatakse, on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], (kollane veresool). POx katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] (punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas pH 6 juures. 1 2+ + peroksüdaas 3+ 2Fe + H2O 2 + 2H 2Fe + 2H2O Töö käik Töö toimus ettevalmistatud tööreaktiiviga. 25 ml tööreaktiivi sisaldab: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi 1,5 mg peroksüdaasi 16,6 ml 0,2M fosfaatpuhvrit, pH=6,0
Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina ka kollast veresoola . Peroksüdaas katalüüsib oksüdatsiooni -ks, sealhulgas vesinikperoksiid redutseeritakse veeks. Tekib punane veresool , mis annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb peroksüdaasile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas . Peroksüdaas 2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Käesolevas töös määratakse glükoosisisaldus mingis bioloogilises objektis, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. Peroksüdaasi substaadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(II). Töö käik: Mahl või mõni muu vedelik
uuritava proovi glükoosisisaldusest. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid erinevaid orgaanilisi ühendeid. Lisaks orgaanilistele ühenditele võib substraadina kasutada K4[Fe(CN)6] (kollane veresool). POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt vesinikperoksiid redutseerub veeks. Tekkiv K3[Fe(CN)6] (punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeriv lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik: Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, milleks mina kasutasin mett. Selleks kasutasin tööreaktiivi, mis sisaldas eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi ja peroksüdaasi ja kromogeenset substraati K4[Fe(CN)6]. Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritava lahusena, milles glükoosi kontsentratsiooni määrama hakkasin, kasutasin mina mee tõmmist
I. Võetakse 1 ml standardlahust (konts. 1 mg/ml) viiakse 15 ml tuubi ja lisatakse 3 ml dest.vett, saadakse lahus nr 1 kontsentratsiooniga 0.25 mg/ml II. Võetakse 2 ml lahust 1 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 2 kontsentratsiooniga 0.125 mg/ml. III. Võetakse 2 ml lahust 2 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 3 kontsentratsiooniga 0.062 mg/ml. 3. Reaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi toatemperatuuril spektrofotomeetri küvettides. Selleks võtsin kuus kuiva küvetti ja nummerdasin neid. Küvett 1: nullproov, dest.vett 250 l Küvett 2: uuritavat proovi 250 l Küvett 3: uuritava proovi paralleel 250 l Küvett 4: glükoosilahust 1 (0.25 mg/ml) 250 l Küvett 5: glükoosilahust 2 (0.125 mg/ml) 250 l Küvett 6: glükoosilahust 3 (0.062 mg/ml) 250 l
· POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. · Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril. Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (mesi). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Töö reaktiivi koostis : (25 ml kolvis sisaldub) · 2,5 mg GOD · 1,5 mg POD · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0 · K3[Fe(CN)6] (K-heksatsüanoferraat(II)) 0,1% lahus, mis täidab kolvi märgini. Uuritava proovi (mee lahus) ettevalmistamine: 1. Kaalusin analüütilisel kaalul kaaluklaasi 0,11 g mett. 2
Kui kasutatakse substraadi, mille oksüdeerimisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektofotomeetriliselt. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine: Taandatud substraat + H2O2 Oksüdeeritud substaat + 2 H2O POx-i toimel oksüdeeruva kromgeense substraadina kasutatakse bensidiini derivaate. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat (III), K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusele 410 nm. Reaktsioon kulgeb PO x-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. 2 Fe2+ +H2O2 + 2H+ 2 Fe 3+ +2 H2O Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on olulisene koht tööreaktiivil, mis sisaldab Gox, Pox, kaaliumheksatsüanoferraati (II) ja fosfaatpuhvrit pH 6. Tööreaktiiv oli valmistatud praktikumi juhendaja poolt. Tundmatu lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine
Õpperühm: YAGB21 Töö teostaja: Alexander Kirichuk Õppejõud: Tiina Randla Õppejõude märkused: Glükoosi sisalduse määrmine. Kas kasutasite korrigeeritud optilise tiheduse väärtusi, millest on kontrollproovi OD maha arvatud? Sellisel juhul peaks graafikul olema koordinaatide alguspunkti läbiv sirge. St et taas tuleb kasutada matemaatilisi manipulatsioone ning punktiparvest too sirge läbi tõmmata. Edasi tuleb uuritava materjali glükoosisisaldus tõepoolest välja arvutada (kus see praegu on?) ja tulemust analüüsida. Sedapuhku saab tulemust võrrelda teooriaga kui palju selline toode tavaliselt glükoosi sisaldab. Teoreetilised alused: Esimene etap: Glükoosisisalduse kvantetatiivseteks määramiseks bioloogilistes objektides rakendatakse sageli enisümaatilist meetodit (kasutatakse ensüümid oksüdaas (GOx) ja peroksüdaas (POx)).
Igasse katseklaasi pipeteeritakse 3 ml tööreaktiivi ja loksutatakse kohe, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Pärast tööreaktivi lisamiseks väärvus muutus kollakaks igas kasteklaasis. Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine Pärast reaktsiooni läbiviimist koostan kaliibrimisgraafiku ja selle abil leian glükoosisisaldust sidruimahlas. Kolv Optiline tihedus (ABS) Opt. tihedus 0 proov 0 proov 0,047 Sidrunimahl 0,083 0,036 KeskmineD väärtus? Sidrunimahl 0,091 0,044 Glükoosilahus 0,25 0,203 0,156 Glükoosilahus 0,125 0,114 0,067 Glükoosilahus 0,062 0,079 0,032 Keskmine väärtus on (0,036 + 0,044)/2 = 0,04 ABS Tulemuseks on 0,02 mg/ml
värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis. Töö käik: 1)Tööreaktiiv oli valmis tehtud. Tööreaktiiv: 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. 2)Uuritavaks lahuseks oli sidruni vesilahus, mille lahjendus oli 1/100. 3) Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel kasutasinstandardlahust, mis sisaldas glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest valmistatasin kolm lahut, mille kontsentratsioon oli 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Selleks võtsin kolm katseklaasi ning esimesse pipeteerisin standardlahust 2,5 ml ning lisasin 7,5 ml dest.vett. Teises katseklaasis tegin esimesest kahekordse lahjenduse ning kolmandas teisest kahekordse lahjenduse.
liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem. POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril. Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (greibimahl). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Uuritava proovi (greibimahla lahjendus) ettevalmistamine: Valmistasin greibimahlast 1:100 lahjenduse. Selleks pipeteerisin automaatpipetiga 0,5 ml pigistatud greibi mahla 50 ml kolbi, täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega ning loksutasin segamini. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks:
POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H 2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. Substraadiks on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik Töötatakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: · 2,5 mg glükoosi oksüdaas · 1,5 mg peroksüdaas · 16,6 ml 0,2M fosfaatpuhver, pH=6,0; · K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahus Tundmatu lahuse ettevalmistamine Uuritav proov on melonilahus
tolidiin, mille helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Mugavaks substraadiks, mida siin töös kasutataksegi, on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik Töötadakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0; K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini.
tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: · 2,5 mg glükoosi oksüdaas · 1,5 mg peroksüdaas · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhver, pH 6,0; · K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahus Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles glükoosi kontsentratsiooni tuleb kindlaks määrata, võib olla Glükoosi vesilahus Mee lahus Hele puuvlija mahl( viinamarja, õuna, sidruni, greibi vm) Mõni füsioloogiline lahus(vereseerum, uriin jne ) Minu uuritavaks prooviks oli sidrunimahl Tegin lahjenduse: 1 ml sidrunimahla ning lisasin destilleeritud vett 25 ml mõõtkolbi kriipsuni. Kui tundmatuks prooviks on naturaalne puuviljamahl või mõni füsioloogiline vedelik, siis igal konkreetsel juhul toimitakse uuriava lahuse ettevalmistamisel ja lahjendusmäära valikul praktikumi juhendaja soovituste järgi. Puuviljamahlade uurimisel lähtutakse reeglina
Glükoosisisaldus arvutatakse massiprotsentides (X%) naturaalse mahla suhtes. X = C × L × 103 × d× 100 = 0,0675×50×10-3×1.031328×100 = 0,348 % Seega sajas grammis sidrunimahlas on katseandmete põhjal glükoosi 0,348g Kirjanduse andmetel sisaldub 100g sidrunimahlas keskmiselt 0,5g glükoosi. Järeldus: Erinevused katsetulemuste ja teoreetiliste kirjandusest pärinevate tulemuste vahel on mõistetavad, sest iga sidrun on pisut erinev ja katsetulemus saadi vaid ühe üksiku sidruni testimisel, kirjandusest on võetud aga keskmine sidruni glükoosisisaldus, mis ilmselt on saadud mitmete sidrunite testimisel. Kasutatud kirjandus: http://www.aqua-calc.com/page/density-table/substance/Lemon-blank-juice-coma-and-blank- raw http://tka.nutridata.ee/showFood.action?food.id=1924
1.1 VALKUDE REAKTSIOONID 1. Nimetage, millised toodud valkude reaktsioonidest on üld-, millised erireaktsioonid ja põhjendage sellist jaotust. Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi: -universaalsed e üldreaktsioonid (biureedireaktsioon-on tingitud peptiidsidemete esinemisest), mis on omased kõikidele valkudele, -spetsiifilised e erireaktsioonid (tiooli-, ksantoproteiini-, Milloni reaktsioon jt), mis on iseloomulikud ainult teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele. 2. Kirjutage aminohappe molekuli üldistatud struktuurivalem. Kuidas aminohappeid klassifitseeritakse radikaali keemilise ehituse järgi? Valkude koostises leidub 20 proteogeenseteks aminohapeteks. Mõningad valgud sisaldavad ka nn ebaharilikke aminohappeid, peamiselt üldlevinud aminohapete hüdroksü-, metüül-, fosforüül- jt derivaate.
Tallinn 2010 SISUKORD 1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA ........................... 4 1.1 VALKUDE REAKTSIOONID ............................................................................... 4 1.1.1 Biureedireaktsioon ....................................................................................... 9 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) ........................................... 10 1.1.3 Milloni reaktsioon ....................................................................................... 10 1.1.4 Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon ................................................................... 11 1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega............................................... 11 1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine) .......... 12 1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st ............. 12
-sse 1 ml uuritavat lahust. 4.-sse, 5.-sse ja 6.-sse 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust. Igasse katseklaasi valatakse 3 ml tööreaktiivi, loksutatakse ja jäetakse 20- ks minutiks reageerima. Reaktsiooni tulemusena katseklaasides 2-6 tekkis helekollane lahus, mis on tingitud punase veresoola sisaldusega lahuses. Viimane etapp on lahuste optilise tiheduse määramine spektrofotomeetril lainepikkusel 410 nm. Kinlda glükoosi kontsentratsiooniga proovide optilise tiheduse tabel ja graafik. 0 0 0,25 0,113 0,125 0,059 0,062 0,029 Tundmatu konstentratsiooniga proovi optilise tihedus: D1 = 0,099, D2 = 0,096, lahutan keskmisest väärtusest 0,03 (esimeses katseklaasis oleva proovi optiline tihedus) ja saan D = 0,0675. Vastavalt graafikule glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses on 0,149 mg/ml. Glükoosisisaldus uuritavas proovis arvutatakse järgamise valemi abil: X= C V 1 L 10 - 3 100 V 2 G ( 1- W )
Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Teooria Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. Täna GOx-i substraadispetsiifilisusele -D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx katalüüsib -D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D- glükoonhappe. Järgmises etapis kasutatakse POx-i mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist kasutades elektronide akseptorina teist substraati, H 2O2, mille oksüdeerumisel moodustub H2O. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiin derivaate, mis on det
Kaliibrimisgraafiku järgi on viinamarjamahla lahuse kontsentratsioon 0,15mg/ml. Lahjendustegur on 400. Algmahla kontsentratsioon on siis 400*0,15= 60 mg/ml Naturaalses mahlas on 60mg/ml glükoosi. 1 ml mahla on 1g mahla, ehk 1000mg mahla. Järelikult: 1000mg 100% = 60*100/1000=6% 60mg x% Kokkuvõte: Tegelikult peaksid viinamarjad sisaldama umbes 7% glükoosi, mis on ligilähedane selle, mis mina sain. Glükoosisisaldus oleneb viinamarjade küpsusest ja katseks võetud ainete mahu täpsusest.
GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL Kasutatavad ained 3 viinamarja mahl, tööreaktiiv: Glükoosi oksüdaas(GOD), peroksüdaas(POD), K4[Fe(CN)6] 0,1 % vesilahus, 0,1 M Fosfaatpuhvrit ph 6. Kemism Glükoosi lahusele lisati tööreaktiivi, kus sisalduv GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GODis sisalduv flaviinadeniindinukleotiid abil oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja vesinikperoksiidiks. Edasi katalüüsib POD kromogeense substraadi kollase veresoola oksüdeerumist. PODi toimel oksüdeerub kollases vere soolas sisalduv Fe+2 Fe+3ks., millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv punane veresool annab lahusele hele kollaka värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Töökäik Kolmest etteantud viinamarjast uhmerdati välja 1ml klaari mahla. Saadud mahl lahjendati destileeritud veega 250 mlni. Õppejõult saadud glükoosi lahusest tehti kolm 4 kordset lahjendust. Esimesse katsekl
annaabi.ee 
Sisene Facebook'ga
Sisene Google'ga
Sisene LinkedIn'ga
