GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL (0)

TTÜ Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Töö nr. 3.3
GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel . GOx-i on substraadispetsiifiline β,D-glükoosi suhtes ning see võimaldab määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul.
β,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas katalüüsib β,Dglükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Produktideks on vesinikperoksiid ja δ,Dglükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe.
GOx on liit- ehk konjugeeritud valk, flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk.FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.
Järgmises etapis kasutatakse rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. POx on sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo - ehk kromoproteiin. See tähendab, et ka POx on liitvalk . POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide dehüdreerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O.
POx-i reaktsiooni saab hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt, kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt . Värvilise ühendi kontsentratsioon on sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni põhimõtteline skeem:
Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(ll), K4[Fe(CN)6] ehk kollane veresool . POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, tekib kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm.
Töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis.
Töö käik:
1)Tööreaktiiv oli valmis tehtud.
Tööreaktiiv: 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse:
2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0;
K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni.
2)Uuritavaks lahuseks oli sidruni vesilahus , mille lahjendus oli 1/100.
3) Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel kasutasinstandardlahust, mis sisaldas glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest valmistatasin kolm lahut , mille kontsentratsioon oli 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Selleks võtsin kolm katseklaasi ning esimesse pipeteerisin standardlahust 2,5 ml ning lisasin 7,5 ml dest.vett. Teises katseklaasis tegin esimesest kahekordse lahjenduse ning kolmandas teisest kahekordse lahjenduse.
4) Võtsin kuus puhast katseklaasi. Katseklaasi nr1 pipeteerisin 1 ml destilleeritud vett,
katseklaasidesse nr 2 ja 3 pipeteerisin 1 ml uuritavat lahust, katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 pipeteerisin igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust.
Igasse katseklaasi pipeteerisin 3 ml tööreaktiivi ja loksutasin koheselt. Ootasin vähemlt 20 minutit ning alustasin optilise tiheduse mõõtmist lahustes, lainepikksusel 410 nm.
Tulemused:
Katseklaasi nr.
Mõõdetud tulemus
Korrigeeritud väärtused
Kontsentratsioon mg/ml
1
0,0557
 
Kesk=0,0321
 
2
0,0869
0,0312
0,045
3
0,0887
0,033
4
0,1941
0,1384
0,25
5
0,1307
0,075
0,125
6
0,0959
0,0402
0,062
x= mg/ml
X=0,045 *100*10-3*1*100=0,45%
Järeldus: Antud katses järeldub, et 100 grammis sidrunimahlas on 0,45 g glükoosi. Kui võrrelda oma tulemust rühma kaaslasega , kes sai tulemuseks 0,49%, siis katseviga ei saanud suur olla. http://ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/list antud leheküljelt leidsin, et värskes sidrunimahlas on umbes 0,99% glükoosi. Kadu on peaaegu 50 %.