3.3. Glükoosisisalduse määramine (0)

3.3. Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel .
GOx-i süstemaatiline nimetus on β,D-glükoosi:O2-oksüdorektaas (EC 1.1.3.4) näitab, et ta katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel.
GOx kujutab ennast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimub koensüümina.
Järgmises etappis kasutatakse peroksüdaaside esindajat, rõika peroksüdaasi (EC 1.11.1.7), mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. Kui kasutata substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine:
Peroksüdaas
Oksüdeeritud substraat + H2O2 → Taandatud substraat + 2 H2O
Värvusetu Värviline
Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 reedutseerimine H2O-ks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6], ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH=6 juures.
Peroksüdaas
2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ → 2 Fe3+ + 2 H2O
Töö käik:
Tööreaktiiv
Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme GOx ja POx, kromogeenset substraadi K4[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
Töötan ettevalmistatud reaktiiviga.
Uuritava lahuse ettevalmistamine
Tundmatuks prooviks on naturaalne apelsiinimahl.
Pressin apelsiinist umbes 5 ml mahla, mida pärast vajalikul määral lahjendan. (1/200 ml).
Selleks valan 200 ml-lise katseklaasi 1 ml apelsiinimahla ja lisan kriipsuni vett.
Glükoosilahuste valmistamine
Kindlakontsetratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standart-lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml.
Standaartlahusest valmistam 3 lahjemat glükoosilahust kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml.
Lahjenduste tegemiseks kasutan samm- sammult lahjendamine.
Et valmistada glükoosilahust kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, võtan 2,5 ml glükoosi standart-lahust ja lisan 7,5 ml dest. vett.
Et valmistada glükoosilahust kontsentratsioonidega 0,125 mg/ml, võtan eelmisest lahusest 5 ml lahust ja lisan 5 ml vett.
Et valmistada glükoosilahust kontsentratsioonidega 0,062 mg/ml, võtan eelmisest lahusest 5 ml lahust ja lisan veel 5 ml dest. vett.
Kõik katseklaasid loksutan hoolikalt.
Värvusreaktsiooni läbiviimine
Reaktsiooni viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures.
Asetan statiivi 6 puhast ja kuiva katseklaasi ja nummerdan.
Katseklaasi nr.1 pipeteerin 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov).
Katseklaasidesse nr.2 ja nr.3 pipeteerin 1 ml apelsiinimahla lahust.
Katseklaasidesse nr.4, nr.5 ja nr.6 pipeteerin igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust.
Igasse katseklaasi pipeteerin 3 ml tööreaktiivi. Kohe loksutan.
Hoian katseklaasid 20 minutit toatemperatuuril, et jõuaksid toimuda teooria osas kirjeldatud reaktsioonid.
20 minuti pärast mõõdan lainepikkusel 410 nm lahuste optilise tiheduse väärtused.
Võrdlahusena kasutan dest. vett.
Minu tulemused:
Katseklaas nr.1: 0,054 A
Katseklaas nr.2: 0,144 A
Katseklaas nr.3: 0, 139 A
Katseklaas nr.4: 0, 186 A
Katseklaas nr.5: 0,117 A
Katseklaas nr.6: 0,085 A
Kuna kontrollproov andis madala optilise tiheduse näidu, siis kõikidest väärtustest (katseklaasid 2-6) lahutan kontrollproovi optilise tiheduse väärtust.
Katseklaas nr.1: 0,054 A
Katseklaas nr.2: 0,144 A - 0,054 A = 0,090 A
Katseklaas nr.3: 0,139 A – 0,054 A = 0,085 A
Katseklaas nr.4: 0,186 A – 0,054 A = 0,132 A
Katseklaas nr.5: 0,117 A – 0,054 A = 0,063 A
Katseklaas nr.6: 0,085 A – 0,054 A = 0,031 A
Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine
Koostan kaliibrimisgraafik katseklaaside nr.4, nr.5 ja nr.6 absorptsiooni väärtuste alusel. Graafiku x- telg näitab glükoosi kontsentratsiooni C (mg/ml) ja y-telg näitab proovi absorptsiooni väärtust (A).
Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses leitakse kaliibrimisgraafiku abil paralleelproovide (katseklaasid nr.2 ja nr.3) keskmise optilise tiheduse väärtuse järgi.
Paralleelproovide keskmine väärtus:
Vaadates graafikule leian glükoosi kontsentratsiooni minu uuritavas lahuses. Kui absorptsioon võrdub 0,0025 A, siis glükoosi kontsentratsioon C = 0,005 mg/ml.
Kuna alguses mina lahjendasin apelsiinimahla, siis oma saadud tulemust pean korrutama lahjendusteguriga.
Apelsiinimahla glükoosi kontsentratsioon võrdub 1 mg/ml.
Glükoosisisaldus massiprotsentides (X, %) naturaalse mahla suhtes arvutatakse vastavalt valemile:
, kus
C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg/ml),
L – mahla lahjendustegur ,
d – mahla tihedus (g/cm3).
Järeldus:
Antud katses õnnestus glükoosisisaldust määrata. Katse protsessis K4[Fe(CN)6] oksüdeerus K3[Fe(CN)6] – ks. Seda oli ka visuaalselt näha, sest katseklaasides lahuse värvus 20 minuti jooksul muutus helekollaseks. Vaadates kaliibrimisgraafikule võib järeldada, et katse oli korrektselt viidud , sest graafik kujutab endast koordinaatide alguspunkti läbivat sirget. Apelsiinimahlas sisalduva glükoosi kontsentratsioon C= 1 mg/ml. Kui arvutada massiprotsentides, siis X = 0,11%.