Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Juhendaja : Tiina Randla
Tallinn 2012
Teoreetilised alused
Bioloogilistes vedelikes kasutatakse glükoosisisalduse määramiseks enamasti ensümaatilist meetodit. See põhineb kahe ensüümi – glükoos oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel .
GOD on substraadispetsiifiline β,D-glükoosi suhtes (tänu sellele võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust teiste taandavate suhkrute juuresolekul).
GOD (β,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas) katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD on liitvalk (flavoproteiin) ja sisaldab prosteetilise grupina (mittevalguline komponent ) flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensüüm.
FADi abil kantakse glükoosi molekulilt kaks H aatomit hapnikule, selle tulemusel glükoos oksüdeerub glükoonhappeks ja tekib FADiga ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi.
POD ( doonor , H2O2-oksüdoreduktaas) osaleb reaktsiooni järgmises etapis . POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem.
POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks.
Substraadiks on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool . POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas.
Töö käik
Töötadakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil.
Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis:

• 2,5 mg glükoosi oksüdaas
  
• 1,5 mg peroksüdaas
  
• 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhver, pH 6,0;
  
• K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahus
  

Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles glükoosi kontsentratsiooni tuleb kindlaks määrata, võib olla
Glükoosi vesilahus
Mee lahus
Hele puuvlija mahl( viinamarja, õuna, sidruni , greibi vm)
Mõni füsioloogiline lahus( vereseerum , uriin jne )
Minu uuritavaks prooviks oli sidrunimahl
Tegin lahjenduse: 1 ml sidrunimahla ning lisasin destilleeritud vett 25 ml mõõtkolbi kriipsuni.
Kui tundmatuks prooviks on naturaalne puuviljamahl või mõni füsioloogiline vedelik, siis igal konkreetsel juhul toimitakse uuriava lahuse ettevalmistamisel ja lahjendusmäära valikul praktikumi juhendaja soovituste järgi. Puuviljamahlade uurimisel lähtutakse reeglina puuviljadest ja pressitakse neist välja väike kogus (2-3 ml) mahla, mida siis vajalikul märral lahjendatakse.
Glükoosilahuste valmistamine kaliirimisgraafiku koostamiseks
Kindla glükoosi kontsentratsiooniga lahuste valmistamiseks lähtusin glükoosi standardlahusest, milles glükoosi kontsentratsioon on täpselt 1,0 mg/ml.

Standardlahusest valmistasin kolm lahjendust, milles glükoosi kontsentratsioon on vastavalt 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml

Lahjenduste valmistamiseks võtsin 3 puhast, kuiva katseklaasi. Esimesse mõõdsin 2,5 ml glükoosi standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vett

Teise võtsin 5 ml lahust esimesest katseklaasist ja lisasin 5 ml destilleeritud vett

Kolmandasse võtsin 5 ml teisest katseklaasist ja lisasin 5 ml dest. vett.
Katse tulemused
 
optiline tihedus
korrigeeritud D
glükoos mg/mL
kontrollproov
0,0658
0
0
oma proov 1
0,1062
0,04
 otsitav
oma proov 2
0,1068
0,04
 otsitav
lahjendus 1
0,2451
0,48
0,25
lahjendus 2
0, 1577
0,091
0,125
lahjendus 3
0,1133
0,18
0,062
Minu uuritava proovi korrigeeritud optiline tihedus oli 0,04. Nagu näha, siis joon ei alga koordinaatide alguspunktist, kuid sellegi poolest asetsevad kõik punktid ühel joonel .
Oma proov1 =0,1062
Oma proov2 =0,0168  ykeskm= 0,1065
Võrrandi y= 0,714x+0,0675 põhjal arvutatud kontsentratsioon tuleb:
X= 0,1065-0,0675 / 0,714 = 0,054 mg/ml
Sidrunimahla tihedus = 1,026 g/cm3 (internetist)
Glükoosisisaldus arvutatakse järgmise valemi järgi:
10-3*d*100, kus
C- glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg/ml)
L- mahla lahjendustegur
d- mahla tihedus (g/cm3)
X= 0,054* 25*10-3*1,026*100 = 0,138 %
Järeldus:
Katse näitas, et kontsentratsiooni suurendamisel absorptsioon kasvab. Sain tulemuseks, et sidrunimahlas oli 0,138% glükoosi.
tka.nutridata.ee andemete põhjal on 100g sidruni glükoosisisaldus 0,6g.