Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemia instituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Laboratoorne töö nr 3.3
Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Tallinn 2013
Teooria
Bioloogilistes vedelikes kasutatakse glükoosisisalduse määramiseks enamasti ensümaatilist meetodit. See põhineb kahe ensüümi – glükoos oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel .
GOD on substraadispetsiifiline β,D-glükoosi suhtes (tänu sellele võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust teiste taandavate suhkrute juuresolekul).
GOD (β,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas) katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD on liitvalk (flavoproteiin) ja sisaldab prosteetilise grupina (mittevalguline komponent ) flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensüüm.
FADi abil kantakse glükoosi molekulilt kaks H aatomit hapnikule, selle tulemusel glükoos oksüdeerub glükoonhappeks ja tekib FADiga ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi.
POD ( doonor , H2O2-oksüdoreduktaas) osaleb reaktsiooni järgmises etapis . POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem.
POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks.
Substraadiks on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool . POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas.
Töö käik
Töötatakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil.
Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis:

• 2,5 mg glükoosi oksüdaas
  
• 1,5 mg peroksüdaas
  
• 16,6 ml 0,2M fosfaatpuhver, pH=6,0;
  
• K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahus
  

Tundmatu lahuse ettevalmistamine
Uuritav proov on melonilahus. Etteantud melonotüki riivisin ära, selle käigus sain vajaliku hulga mahla, millest kasutasin 1 ml. Saadud mahla lahjendasin destilleeritud veega 50ml mahuni, seega teostasin 50 kordse lahjenduse.
Glükoosilahuste valmistamine kaliirimisgraafiku koostamiseks
Kindla glükoosi kontsentratsiooniga lahuste valmistamiseks lähtusin glükoosi standardlahusest, milles glükoosi kontsentratsioon on täpselt 1,0 mg/ml.

Standardlahusest valmistasin kolm lahjendust, milles glükoosi kontsentratsioon on vastavalt 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml

Lahjenduste valmistamiseks võtsin 3 puhast, kuiva katseklaasi. Esimesse mõõtsin 2,5 ml glükoosi standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vett.

Teise võtsin 5 ml lahust esimesest katseklaasist ja lisasin 5 ml destilleeritud vett

Kolmandasse võtsin 5 ml teisest katseklaasist ja lisasin 5 ml vett.

Saadud lahjendusi loksutasin hoolikalt läbi.
Reaktsiooni tööreaktiiviga viisin läbi katseklaasides toatemperatuuril.

Selleks asetasin statiivile 6 puhast kuiva katseklaasi ja märkisin need numbritega.

Katseklaasi nr. 1 pipeteerisin 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov)

Katseklaasidesse 2 ja 3 pipeteerisin 1ml melonimahla lahust (paralleelproovid)

Katseklaasidesse 4, 5, 6 pipeteerisin igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust ( lahjendused)

Igasse klaasi pipeteerisin veel 3 ml tööreaktiivi ja loksutasin hoolikalt.

Hoidsin katseklaase 20 minutit toatemperatuuril. Glükoosi sisaldavad lahused värvusid nõrgalt helekollaseks.

Mõõdsin spektrofotomeetril lahuste optilised tihedused lainepikkusel 410 nm, kasutades võrdluslahusena destilleeritud vett.
Katse tulemused

• Nr4 konsentratsioon on 2,5/10 = 0,25 mg/ml
  
• Nr5 konsentartsioon on 1,25/10 = 0,125 mg/ml
  
• Nr6 konsentratsioon on 0,625/10 = 0,0625 mg/ml
  

Optiline tihedus ABS
Korrigeeritud tihedus ABS
Glükoos mg/ml
kontrollproov
0,047
0
0
Oma proov 1
0,181
0,134
Oma proov 2
0,183
0,136
Lahjendus 1
0,156
0,109
0,25
Lahjendus 2
0,098
0,051
0,125
Lahjendus 3
0,071
0,024
0,062
Paralleelproovide keskmine optiline tihedus on (0,134+0,136)/2 = 0,135 ABS. Kaliibrimisgraafiku järgi on melonimahla lahuse kontsentratsioon 0,36 mg/ml
Kalibreerimisgraafikult lugesin andmed järgnevalt: kuna tegemist on lineaarse sirgega , võin jagada otsitava suuruse (0,135) kahega, kuna graafik pole piisavalt suur, et otsitavat suurust kohe leida, vastava suuruse, mis sain – 0,18, korrutan aga kahega, et saada vajalikku suurust. Selle alusel sain graafikult 0,36 mg/ml
Alglahuse konsentratsioon on 0,36mg/mL x 50mL = 18 mg/mL
Glükoosisisaldus arvutatakse järgmise valemi järgi:
, kus
C - glükoosi konts. uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule = 0,36 mg/ml
L – mahla lahjendustegur = 50
10-3 – tegur üleminekuks grammidele
d- mahla tihedus = 1g/cm3
Järeldus
Glükoosi sisaldus melonis on ligikaudu 2,68%. Minu katse tulemuseks on 1,8%. Erinevus võis tulla meloni küpsuse astmest või koguste ebatäpsustest või ebapiisavast loksutamisest.