GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL (0)

Tallinna Tehnikaülikool
TTÜ keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Laboratoorne töö 3.3
GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
Õppejõud: Priit Eek, Kaia Kukk
Tallinn 2013

Sisukord

Sissejuhatus 3
Teoreetiline osa 4
Töö käik 5
Tööreaktiiv 5
Meloni lahuse ettevalmistamine 5
Glükoosilahuste valmistamine 5
Värvusreaktsiooni läbiviimine 6
Katse andmed 7
Kaliibrimisgraafik 7
Arvutused 7
Järeldused 8
Kasutatud kirjandus 9

Sissejuhatus

Laboratoorse töö 3.3 teemaks oli glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil.
Tegemist oli kvantitatiivse määramisega. Bioloogilise objektina oli kasutusel melon.
Järgnevalt on toodud lühikokkuvõte glükoosist ja selle omadustest, samuti katse sooritamiseks vajalik teoreetiline osa ning seejärel katse kirjeldus ja järeldused.

Teoreetiline osa

Glükoos ehk viinamarjasuhkur on monosahhariid , mis kuulub disahariidide sahharoosi ja laktoosi koostisesse. Loomsetes organismides on glükoos energiaallikaks, seda glükogeeni kujul. Taimedes on glükoos oluline rakukesta komponent , moodustades tselluloosi polümeerse molekuli. Taimede glükoosivarud on tärklisena seemnetes ja mugulates.
Glükoosisisalduse määramine põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel . GOx katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on H2O2 ja δ,D-glükonolktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D‑glükoonhappe (H2O2 ja D-glükoonhape moodustuvad ekvimolaarses koguses). POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist. Värvilise produkti puhul saab POx- reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Seejuures on värvilise ühendi kontsentratsioon võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. See on tingitud lisatud ainete kogustest. Joonis 1: glükoosi anomeerid
Skeemil on substraadid valesti märgitud. Võrrandi vasakul pool peaks olema värvusetu taandatud substraat ehk kromogeenne substraat (kasutusel mitmed orgaanilised ühendid) ja paremal pool värviline oküdeeritud substraat. Antud töös on kromogeense substraadina kaasutusel kollane veresool K4[Fe(CN)6]. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, tekib punane veresool K3[Fe(CN)6]. Viimase kogus on võrdelises sõltuvuses oksüdeeritud glükoosi kogusega, sest GOx reaktsioonil saame ekvimolaarses koguses oksüdeeritud glükoosi ja vesinikperoksiidi. Mida intensiivsem on lahuses punase veresoola kollane värvus, seda kõrgem on tema optiline tihedus ja seetõttu ka glükoosi sisaldus.
Antud töös on substraadina kasutusel kaaliumheksatsüanoferraat(II) K4[Fe(CN)6] ehk ajaloolise nimetusega kollane veresol. Tekkiv punane veresool K3[Fe(CN)6] annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas pH 6 juures.

Töö käik

Tööreaktiiv

Juba valmisolev tööreaktiiv sisaldab ensüüme GOx ja POx, kromogeenset substraati K4[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse:
2,5 mg glükoosi oksüdaasi GOx
1,5 mg peroksüdaasi POx
16,6 ml 0,2 M puhverlahust
K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust, et täita kolb lõppmahuni.
Tööreaktiivi tuleb säilitada külmkapi temperatuuril kuni tarvitamiseni. Meie reaktiiv oli juba laual valmis, kuna enne kasutamist pidi see taas soojenema toatemperatuurini.

Meloni lahuse ettevalmistamine

Minu katses oli tundmatuks prooviks naturaalne melonimahl. Mahla kättesaamiseks surusin viljaliha noaga ja tilgutasin mahla pisikesse keeduklaasi. Pidin tegema mahlast 250-kordse lahjenduse. Selleks pipeteerisin automaatpipetiga 1 ml melonimahla 250 ml koonilisse kolbi (mõõtkolbi, tähistatud oli 250 ml joon). Lahjendasin mahla destilleeritud veega. Vett lisasin kuni 250 ml kriipsuni. Mõõtmine toimus silma järgi. Kuna mahla lahus jäi hägune, filtreerisin osa sellest katseklaasi.

Glükoosilahuste valmistamine

Glükoosi kontsentratsiooni määramiseks tundmatus proovis tuleb koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni mõõdetava optilise tihedusega.
Lähtutakse glükoosi standardlahusest, mille kontsentratsioon on 1,0 mg/ml. Seejärel valmistatakse kolm lahjendust kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjendamiseks oli kasutusel destilleeritud vesi. Lahjendamisel jälgisin skeemi:
Joonis 2: kaliibrimislahuste valmistamise skeem

Värvusreaktsiooni läbiviimine

Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi toatemperatuuril. On vaja kuute puhast ja kuiva katseklaasi. Katseklaasid nummerdatakse 1-6.

Kontrollkatse ehk 0- proov – 1 ml destilleeritud vett

Uuritav lahus – 1 ml 250x melonimahla lahjendust

Sama, mis katseklaasis nr. 2

Glükoosi lahjendus 1 – 1 ml 0,25 mg/ml glükoosilahust

Glükoosi lahjendus 2 – 1 ml 0,125 ml/mg glükoosilahust

Glükoosi lahjendus 3 – 1 ml 0,062 mg/ml glükoosilahust
Igasse katseklaasi lisatakse seejärel 3 ml tööreaktiivi ja loksutatakse koheselt. Fikseeritakse reaktsiooni algusaeg . Katseklaase hoitakse toatemperatuuri 20 minutit.
Pärast ootamist mõõdetakse lainepikkusel 410 nm lahuste optilise tiheduse väärtused.

Katse andmed

λ = 410 nm

A = 0,055

A = 0,094

A = 0,093

A = 0,198

A = 0,127

A = 0,088
Paralleelproovide 2 ja 3 keskmine A = (0,094 + 0,093) / 2 = 0, 0935

Kaliibrimisgraafik

Kasutan graafiku tegemisel mõõdetud suurusi. Sellega seoses muutus kaliibrimissirge võrrand ning järgnevad arvutused saavad muudetud.

Arvutused

Kaliibrimisgraafiku võrrandi järgi leian glükoosi kontsentratsiooni:
Paralleelproovide keskmine A = 0,0935 = y
y = 0,5756x + 0,0541
0,0935 = 0,5756x + 0,0541
0,5756x = 0,0394
x = 0,0685
Võrrandi lahendamisel sain teada, et glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses oli 0,0685 mg/ml.
Nüüd leian glükoosisisalduse massiprotsentides (X, %). Kasutan järgmist valemit:
, kus
C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses (0,0685 mg/ml )
L – mahla lahjendustegur (250)
d – mahla tihedus (1,1 g/cm3)

Järeldused

Minu esialgsed arvutused olid ilmselgelt valed. Katse näitas, et melonis on glükoosisisaldus 1,56%.
See tähendab, et minu võetud 1 ml-s melonimahlas, mille mass oli ~1,1 g, oli glükoosi 17,2 mg.
Kirjanduse järgi on melonis süsivesikuid kokku 4% ja meloni mahlas 10%. Teised allikad annavad tõepoolest teistsuguse glükoosisisalduse (~2%). Arvestades seda, et minu melon oli võrdlemisi kõva ja rohekas ehk siis toores , võin lugeda katse õnnestunuks.

Kasutatud kirjandus

Malle Kreen , Terje Robal , Tiina Randla „ Biokeemia laboratoorsed tööd“ , Tallinn 2010
Internet
Glükoos ja selle omadused: http://et.wikipedia.org/wiki/Glükoos
Meloni mahla tihedus: http://www.wolframalpha.com/input/?i=melon+juice
Joonised
Joonis 1: http://umanitoba.ca/Biology/BIOL1020/lab2/images/GlucoseForms.jpg
Joonis 2: Malle Kreen, Terje Robal, Tiina Randla „Biokeemia laboratoorsed tööd“ , Tallinn 2010, lk 90