Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (0)

Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil

Teooria

Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel . Täna GOx-i substraadispetsiifilisusele β-D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx katalüüsib β-D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe.
Järgmises etapis kasutatakse POx-i mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist kasutades elektronide akseptorina teist substraati, H2O2, mille oksüdeerumisel moodustub H2O.
POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiin derivaate, mis on detekteeritavad vastavatel lainepikkustel.

Töö käik

• Õppejõult saadi prooviks sidrunimahl
  
• Sidrunimahlast tehti 20x lahjendus ja filtriti
  
• Valmistati 1mg/ml glükoosilahsest kaliibrimislahus glükoosi sisaldusega 0,25mg/ml ning sellest kaks lahjendust konsentratsioonidega 0,125mg/ml ja 0,062mg/ml
  
• Seati valmis ja nummerdati 6 puhast katseklaasi
  
• Katseklaasi
  
  • Nr 1 pipeteeriti 1ml destileeritud vett
    
  • Nr 2 ja 3 pipeteeriti 1ml uuritavat lahust
    
  • Nr 4,5 ja 6 pipeteeri igasse 1ml erineva konsentratsiooniga glükoosilahust.
    
• Igasse katseklaasi pipeteeriti 3ml eelnevalt valmistatud tööreaktiivi* ja loksutati
  
• Katseklaase hoiti 20 minutit toatemperatuuril
  
• Spetrofotomeertia põhimõttel mõõdeti optilised tihedused katseklaasides
  

*Õppejõu poolt valmistatud 25ml tööreaktiiv koosnes:

• 2,5mg glükoosi oksüdaasi
  
• 1,5mg peroksüdaasi
  
• 16,6ml 0,2M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0
  
• K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust, millega täideti kolb kuni lõppmahuni.
  

Optilised tihedused

0,048

0,059

0,060

0,146

0,100

0,076
Korrigeeritud optilised tihedused

0

0,011

0,012

0,098

0,052

0,028
Kaliibrimisgraafik
Tabelilt leitud konsentratsioon, mis vastab optilisele tihedusele 0,012 on 0,02mg/ml
Glükoosisisalduse arvutamine
Sidrunimahla tihedus on pärit sellelt leheküljelt: http://www.aqua-calc.com/page/density-table/substance/Lemon-blank-juice-coma-and-blank-raw

Analüüs

Glükoosi sisaldust määrasin sidrunimahlast, kasutades tööreaktiivi, mis sisaldas glükoosi oksüdaasi ja peroksüdaasi ning kaaliumheksatsüanoferraati(II). Glükoosisisalduseks määrasin 4,1%, kirjanduse alusel on keskmiseks sisalduseks 5.6%, seega on tekkinud 1,5% viga mõõtmistel või on seisnud sidrunimahl ajapikku kaotanud osa oma glükoosist.