Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Biokeemia
Laboratoorne töö 3.3
Teostaja:
2016

3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil

Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides (vereseerum, toiduained jm) kasutatatkse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel . Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele ẞ,D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul.
GOx-i süstemaatiline nimetus ẞ,D-glükoosi:O2-oksüdoreaduktaas (EC 1.1.3.4) näitab, et ta katalüüsib ẞ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Produktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsides moodustab D-glükoonhappe.
GOx kujutab endast liitvalku, täpsemalt flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponentina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad .
FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerides FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükooshapet ja vesinikperoksiidi.
Järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna esindajat, rõika peroksüdaasi (EC 1.11.1.7), mille süstemaatiline nimetus on doonor :H2O2-oksüreduktaas. Pox on samuti liitvalk, mille mittevalguline komponent on heem, olles seega hemo - ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerimisel moodustub vesi.
Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat), saab POx-i reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Lahuse värvuse intensiivsus on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.
POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt. O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm.
Lisaks võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4(Fe(CN)6) ehk kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasneb H2O2 redutseerumine veeks . Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas happelises keskkonnas (pH=6).

Töö käik

Töö ülesanne

Glükoosisalduse määramine mingis bioloogilises objektis (mesi, puuviljad jm), mis töö lihtsustamise eesmärgil ei sisalda palju värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse kaaliumheksatsüanoferraat(II).

Tööreaktiiv

Keskses rollis glükoosisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit, mille pH on 6,0. Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil oli tööreaktiiv ette valmistatud.

Uuritava lahuse ettevalmistamine

Minu uuritavaks lahuseks , mille glükoosisisaldust määrasin, oli apelsinimahl . Mahla pressisin apelsini lõigust välja. Võtsin saadud kogusest 1,5 ml, mille lahjendasin 200 ml destilleeritud veega. Osa saadud lahusest filtrisin , et vabaneda puuviljatükkidest.

Glükoosilahuste valmistamine kaliibirimisgraafiku koostamiseks

Glükoosi kontsentratsiooni teada saamiseks tundmatus proovis tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik , mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) ehk optilise tihedusega (D) lainepikkusel 410 nm. Graafiku x- telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (= optiline tihedus) väärtust nimetatud lainepikkusel.
Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtusin glükoosi standard-lahusest, mille glükoosisisaldus oli täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust, mille kontsentratsioonid olid 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Esimese lahuse valmistamiseks võtsin 2,5 ml standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vett. Teise lahuse valmistamiseks võtsin esimesest lahusest 5 ml ja lisasin sellele 5 ml vett. Kolmas lahus valmis analoogselt teisele.

Värvusreaktsiooni läbiviimine

Reaktsiooni viisin läbi toatemperatuuril. Võtsin 6 puhast ja kuiva katseklaasi ning nummerdasin need. Kontrollkatse ehk 0- proov näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni, see viiakse läbi destilleeritud veega. Uuritava lahusega tegin 2 paralleelkatset, glükoosi standardlahusest valmistatud erinevate kontsentratsioonidega lahjendustega tegin igaühega ühe katse. Katseklaasi number 1 pipeteerisin 1ml destilleeritud vett, katseklaasidesse number 2 ja 3 olin juba varasemalt filtrima pannud 1ml uuritavat lahust, milleks oli lahjendatud apelsinimahl. Katseklaasidesse 4, 5 ja 6 pipeteerisin igaühte 1ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust.
Igasse katseklaasi lisasin 3 ml tööreaktiivi ning loksutasin segu kohe, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Märkisin üles reaktsiooni alguse aja. Katseklaase hoidsin 20 minutit toatemperatuuril, mis on piisav reaktsiooniaeg, et jõuaksid toimuda reaktsioonid, mille tulemusena glükoosi sisaldavad lahused jõuavad värvuda K-heksatsüanoferraat(III) toimel kollaseks.
20 minuti möödudes mõõtsin lainepikkusel 410 nm lahuste optilise tiheduse väärtused. Võrdluslahusena kasutasin destilleeritud vett.
Katsetulemused :
 
Optiline tihedus D
Glükoos mg/ml
0-proov
0
0
Proov 2
0,144
Teadmata
Proov 3
0,083
Teadmata
Proov 4
0,100
0,25
Proov 5
0,051
0,125
Proov 6
0,026
0,062

Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine

Kaliibriisgraafiku koostasin standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosi kontsentratsiooniga proovide absorbtsiooni (optilise tiheduse) väärtuste alusel. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentartsiooni (C, mg/ml) ja y-telg proovi absorptsiooni väärtust (A). Kui kasutatakse niinimetatud korrigeeritud absorptsiooni väärtusi ja eksperiment on korrektselt läbi viidud, siis on graafikuks sirge, mis läbib koordinaatide alguspunkti. Glükoosi kontsentratsiooni uuritavas lahuses leidsin kaliibrimisgraafiku abil paralleelproovide keskmise optilise tiheduse väärtuse järgi.
Minu kahe paralleelproovi keskmine optiline tihedus oli 0,0985. Graafikult vastab sellele glükoosissisaldus 0,24 mg/ml. Kuna 1,5 ml mahla lahjendasin 200 ml mahuni, siis järelikult puhtas mahlas oli umbes 32 mg/ml

Glükoosisisaldus massiprotsentides (X, %)

Kuna tundmatuks prooviks oli mahl , mille kuivainesisaldust pole kindlaks määratud, siis avaldatakse glükoosisisalduse massiprotsentides naturaalse mahla suhtes. Valem:
X = C · L · 10-3 · 100/d
C = glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg/ml): 0,24
L = mahla lahjendustegur: 200/1,5 = 133,3
d = Mahla tihedus (g/cm3): 1
X= 0,24 · 133,3 · 10-3 · 100/1 = 3,2%
Tervise Arengu Instituudi kodulehelt leidsin, et keskmiselt on glükoosi sisaldus 100g söödava osa kohta 2,2g, seega glükoosisisaldus 2,2%. Minu leitud glükoosisisaldus on veidi suurem.
Kasutatud allikas: Suhkrusisaldus toiduainetes. Tervise Arengu Instituut. http://toitumine.ee/kuidas-tervislikult-toituda/toidusoovitused/magusad-ja-soolased-naksid/suhkur-ja-magusained/suhkrusisaldus-toiduainetes