GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL (7)

TTÜ keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0060 Biokeemia
Laboratoorne töö nr: 3.8. Töö pealkiri: GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL Töö teostaja : MIHKEL HEINMAA Õpperühm: YAGB22 Õppejõud: MALLE KREEN Töö teostatud: 26/04/2010 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL (3.8)
Teooria
Glükoosisisalduse kvanitatiivseks määrmaiseks bioloogilistes vedelikes kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb kahe ensüümi ­ glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel . GOD on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes, mis võimaldab meetodit kasutada ka teiste taandavate suhkrute juuresolekul.
GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD sisaldab flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensümm. FAD kaasabil kantakse glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit hapnikule, mille tulemusena oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja tekib viimasega ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi.
Reaktsiooni järgmises etapis osaleb POD, mis sisaldab prosteetilise rühmana heemi. POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). Teine substraat ­ H2O2 toimib seejuures kui vesiniku aktseptor, redutseerudes H2O-ks.
Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses glükoosisisalduses uuritavas proovis. Reaktsiooni põhimõttleine skeem:
POD toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina võib kasutada väga erinevaid keemilisi ühendeid. Üheks võimalikuks substraadiks on o- tolidiin, mille helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 630 nm.
Mugavaks substraadiks, mida siin töös kasutataksegi, on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool . POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik
Töötadakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil.
Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0; K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini.
Uuritav proov on mee lahus. Mee lahus valmistatakse kuuma destilleeritud veega, et soodustada suhkrute ja mees sisalduvate kõrgmolekulaarsete süsivesikute lahustumist. Läbisegatud mee proovist kaaluti analüütilistel kaaludel 0,15 g mett. Kaalukausis olev meeproov viidi kadudeta 250 ml mahuga mõõtekolbi. Seda tehti kuuma destilleeritud veega. 2/3 kolvi mahust täideti kuuma destilleeritud veega ja kolbi hoiti kuumas vesivannis veel 15-20 min, aeg-ajalt loksutades. Seejärel lahus jahutati toatemperatuurini. Peale seda täideti kolb külma destilleeritud veega kuni kaelal oleva märgini, suleti korgiga ja loksutati. Kuna ettevaatamatusest ületas vedeliku üldmaht 250 ml piiri, siis arvestan mahuks 251 ml.
Glükoosilahuste valmistamine kaliirimisgraafiku koostamiseks. Kindla glükoosi kontsentratsiooniga lahuste valmistamiseks lähtuti glükoosi standardlahusest, milles glükoosi kontsentratsioon on täpselt 1,0 mg/ml. Sellest valmistati rida glükoosilahuseid ehk lahjendusi. Valmistati 3 lahjendust, milles glükoosi kontsentratsioon on vastavalt 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjenduste valmistamiseks võeti 3 puhast, kuiva katseklaasi. Esimesse mõõdeti 2,5 ml glükoosi standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vette. Teise võeti 5 ml lahust esimesest katseklaasist ja lisati 5 ml destilleeritud vett. Kolmandasse võeti 5 ml teisest ja lisati 5 ml vett.
Reaktsioon tööreaktiividega viidi läbi katseklaasides toatemperatuuril. Selleks asetati statiivile 6 puhast ja kuiva katseklaasi, mis markeeriti numbritega. Katseklaasi '0' pipeteeriti 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov). Katseklaasidesse '1' ja '2' pipeteeriti 1 ml uuritavat lahust (paralleelproovid). Katseklaasidesse '3', '4' ja '5' pipeteeriti igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust, mis eelnevalt valmistati. Igasse klaasi pipeteeriti 3 ml tööreaktiivi ja loksutati kohe, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Fikseeriti aeg ja katseklaase hoiti 20 min toatemperatuuril. Eelpool kirjeldatud reaktsioonide tulemusel värvuvad glükoosi sisaldavad lahused kollaseks. Spektrofotomeetril mõõdetakse lainepikkusel 410 nm lahuste ptilise tiheduse väärtused, kasutades võrdluslahusena destilleeritud vett. Tulemused
Klaliibrimisgraafiku koostamine
[Glyc] mg/ml D Korrigeeritud D 0 0,032 0 0,25 0,150 0,118 0,125 0,075 0,043 0,062 0,057 0,025 0,12 0,11 0,1 0,09 0,08 korrigeeritud D
0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0,22 0,24 [Glyc] mg/ml
Tegelik Läbi tõmmatud sirge
Glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine
Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses leitakse kaliibrimisgraafikult vastavalt paralleelproovide keskmisele optilise tiheduse väärtusele.
Proov D Korrigeeritud D 0 0,032 0 Mesi 1 0,110 0,078 Mesi 2 0,112 0,08 Keskmine Korrigeeritud D: 0,079
Glükoosi sisaldus uuritava proovi kuivaines (X, %) arvutatakse vastavalt valemile:
C ­ glükoosi konts. mee lahuses (kaliibrimissirge järgi), mg/ml 0,168 V1 ­ mee lahuse üldmaht, ml 251 L ­ lahjendustegur 1 10-3 ­ tegur üleminekuks grammidele V2 ­ värvusreaktsiooni läbiviimiseks võetud uuritava lahuse maht, ml 4 G­ mee kaalutis , g 0,15 W­ mee niiskusesisaldus , % 17
Tüüpilise mee glükoosi sisaldus kirjanduse ( http://en.wikipedia.org/wiki/Honey#Nutrition ) andmetel on 31,3 %. Eksperimentaalselt saadud tulemus 43,9 % erineb sellest suhteliselt vähe. Seega pean tulemust õigeks ja tööd õnnestunuks.