Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil. (0)

Biokeeemia laboratoorne töö No 2
Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil.
Õpperühm: YAGB21
Töö teostaja : Alexander Kirichuk
Õppejõud: Tiina Randla
Õppejõude märkused:
Glükoosi sisalduse määrmine. Kas kasutasite korrigeeritud optilise tiheduse väärtusi, millest on kontrollproovi OD maha arvatud? Sellisel juhul peaks graafikul olema koordinaatide alguspunkti läbiv sirge. St et taas tuleb kasutada matemaatilisi manipulatsioone ning punktiparvest too sirge läbi tõmmata. 
Edasi tuleb uuritava materjali glükoosisisaldus tõepoolest välja arvutada (kus see praegu on?) ja tulemust analüüsida. Sedapuhku saab tulemust võrrelda teooriaga - kui palju selline toode tavaliselt glükoosi sisaldab. 
Teoreetilised alused:
Esimene etap:

• Glükoosisisalduse kvantetatiivseteks määramiseks bioloogilistes objektides rakendatakse sageli enisümaatilist meetodit (kasutatakse ensüümid oksüdaas (GOx) ja peroksüdaas (POx)).
  
• GOx (süstemaatiline nimetus β,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas) ja POx on spetsifilised, mis annab võimalust glükoosimääramiseks teist shuhkrute juureolekul.
  
• GOx on konjugeeritud valk (flavoproteiin).Sisaldab mittevalgulisi komponente FAD. FAD toimub koensüümina.
  
• GOx katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel.
  

Reaktsiooniproduktid:

• Vesinikperoksiid H2O2
  
• δ ,D-glükonolaktoon (hüdrolüüsi tulemusena moodustab D-glükoonhape
  

• FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Selle tulemuseks tekib vesinikperoksiid ja D-glükoonhape.
  

Teine etap:

• Teisel etaapil kasutatakse rõika peroksüdaasi (süstemaatiline nimetus on doonor :H2O2-oksüdoreduktaas.)
  
• POx on hemoproteiin.
  
• POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina H2O2 (moodustub H2O).
  
• Kui substraati oksüdeerimisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat ), siis saab POx reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon sõltub glükoosisisaldusest.
  

Oksüdeeritud substrat + H2O2 → taandatud substraat + H2O
värvitu värviline

• Oksüdeeruva kromogeense substraadinan kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate. Meie juhul aga kasutame kaaliumheksatsüaanoferraati(II), veresool ).
  
• 2 Fe2+ + H2O2 + 2H+ → 2Fe3+ + 2H2O
  

kollane veresool punane veresool

• Punane veresool annab lahusele kollase värvuse. Detekteeritav lainepikkus 410 nm.
  
• Sobiv keskkonna pH on 6.
  

Töö käik.

• 1) Tööreaktiivi valmistamine (25 ml): (tööreaktiv on vajalik glükoosisisalduse määramiseks).
  

• 2,5mg glükoosi oksüdaasi
  
• 1,5 mg püroksüdaasi
  
• 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0
  
< 0,1-list lahustkoguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks lõppmahuni.

• 2) Uuritava lahuse ettevalmistamine.
  

Uuritavaks lahuseks kasutame mandariinimahle lahuse. Võtame 2-3ml mahla ja lahjendame (1:100)

• 3) Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks .
  

• Glükoosi kontsentratsiooni uuritavas lahuses kindlaks teha, tuleb aluseks koostada koliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga lainepikkusel 410 nm.
  
• Valmistame 3 kaliibrimislahuse: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml
  
• Selle jaoks võtakse 3 puhast kolbi, ja samm- sammult lahjendamise meetodi kasutamisel valmistame kolme erineva glükoosilahuse.
  

• 4) Värvusreaktsiooni läbiviimine.
  

• 6 Katseklaasi asetatakse statiivi.
  
• Igale lisatakse erinevaid proovi:
  

• 0- proov (destileeritud vesi). Kasutatakse võrdluslahusena.
  
• 2 katseklaasi 1ml uuritava lahusega
  
• 3 katseklaasi kaliibrimislahustega
  

• Igasse katseklaasidesse pipeteeritakse 3ml tööreaktiivi ja loksutakse.
  
• Katseklaasi hoitakse 20 minutit toatmperatuuril.
  
• Mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm lahuste optilise tiheduse väärtused.
  

• 5) Koostame kaliibrimisgraafiku.
  

Töö tulemused.
Lahus:
Absorbtsiooni väärtus:


kalibrimislahused
Glükoosilahus 1 (0,25 mg/ml)
0,1318 ABS
Glükoosilahus 2 (0.125 mg/ml)
0,0947 ABS
Glükoosilahus 3 (0,062 mg/ml)
0,0576 ABS
0-proov
vesi
0,0293 ABS
Uuritavad lahused
Mahl 1
0.1273 ABS
Mahl 2
0,1185 ABS
M1 ja M2 keskmine väärtus
0.1229 ABS

Kalibrimisgraafik:
X- glükoosi kontsentratsioon (mg/ml)
Y- optiline tihedus (ABS)

Seda graafikut kasutades võime leida mahla proovi glükoosi kontsentratssiooni.
Lisame mahla proovide keskmine optilise tiheduse väärtust meie graafikule. (0,1229 ABS)

• Saame niisugust pildi... Siin näeme et meie mahla proovi glükoosi kontsentratsioon on 0,217 mg/ml
  

• Nüüd otsime glüükoosisisaldus massiprotsentides proovi kuivaines. (X %)
  

Kasutame seda valemi:
Kus:

• C-glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgrafilkule
  
• D- mahla tihedus (mandariinil on 1,038 g/cm3)
  
• L – mahla lahendustegur (100 korda)
  

X= 0,217*100*100*0,001*1,038= 2,25%
Apelsiini mahl sisaldab kopkku 2,34 g glükoosi 100g mahla kohta.
Olime lahjendanud mahla 100 korda. Leidnud 100 korda lahjendanud mahla kontsentratsioon on 0,217mg/ml, järelikult lahjandamata mahla 1 grammis on 0,217*100=21,7 mg glükoosi, 100 grammi kohta aga 12,3*100=1230mg glükoosi, järelikult leidnud glükoosisisaldus on 2,17g 100g mahla kohta.
Kokkuvõte:
Antud töös olime määranud glükoosi sisalduse ensümaatilisel meetodil. Meie tulemuseks on 2,17 g 100g mahla kohta.
Teatmeteosest:Apelsiini mahl sisaldab kopkku 2,34 g glükoosi 100g mahla kohta. Tõeline glükoosi kontsentratsioon on piisavalt sarnane meie poolt leidnud kontsenntratsiooniga, järlikult töö on tehtud korrektselt.
Parandatud graafik