Biokeemia Glükoosisisalduse määramine (0)

Laboratoorne töö V
Üliõpilane: Meelika Lukner (155308)
Kuupäev: 22.04. 2016
Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Glükoosisisalduse ensümaatiline meetod põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel . Kuna GOx on niivõrd substraadispetsiifiline β,D-glükoosi suhtes, võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul.
GOx (β,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas) kujutab endast liitvalku, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD). GOx-i molekul ise on dimeerne valk. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit ning kannab need molekulaarsele hapnikule. Tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.
POx, antud töös rõika peroksüdaas ( doonor :H2O2-oksüdoreduktaas), on samuti liitvalk , mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. Viimane teeb sellest valgust hemo - ehk kromoproteiini. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina vesinikperoksiidi, mille redutseerumisel moodustub vesi.
POx-i reaktsiooni saab jälgida spektrofotomeetriliselt, kui kasutada substraati, mile oksüdeerumisel tekib kromogeenne substraat (värviline produkt ). Värvi intensiivsus on võrdeline uuritava proovi glükoosisisaldusega.
Kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate nagu näiteks diaminobensidiin, tetrametüülbensidiin, samuti 2-tolidiin jt. Antud töös kasutatakse substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II) (K4[Fe(CN)6]) ehk kollast veresoola. POx katalüüsib raud(II) raud(III)-ks ja vesinikperoksiid redutseerub veeks . Kaaliumheksatsüanoferraat(III) (K3[Fe(CN)6]) ehk punane veresool anna lahusele kollase värvuse, mis on dekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures.
Töö käik
Tööreaktiiv on eelnevalt juba valmis tehtud, seega alustan tööd uuritava lahuse ettevalmistamisest. Kuna minu valitud uuritav aine on õunamahl , siis juhendaja näpunäidete järgi teen sellest 100-kordse lahjenduse. Selleks võtan 1 ml mahla ja pipeteerin selle 100 ml mõõtkolbi ning kolvi destilleeritud veega kuni märgini. Segan lahuse korralikult läbi.
Et glükoosi kontsentratsiooni proovis kindlaks teha, tuleb koostada kaliibrimisgraafik . Kindlakontsentratsioonilise glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standardlahusest (1 mg/ml). Sellest valmistatakse kolm lahjendust kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Võtan 3 puhast ja kuiva katseklaasi. Esimesse mõõdan 2,5 ml standarlahust ja 7,5 ml destilleeritud vett. Teise 5 ml esimest lahust ja 5 ml destilleeritud vett. Kolmandasse 5 ml teist lahust ja 5 ml destilleeritud vett. Loksutan kindlasti pärast iga lahjenduse tegemist katseklaasi hoolikalt läbi, et kontsentratsioonid ühtlustuksid.
Värvusreaktsiooni läbiviimiseks võtan 6 puhast, kuiva katseklaasi.
1.katseklas – 0- proov , pipeteerin 1 ml destilleeritud vett
2. ja 3. katseklaas – pipeteerin 1 ml uuritavat lahust (100-kordselt lahjendatud õunamahla lahus)
4., 5. ja 6. katseklaas – pipeteerin igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust
Pipeteerin igasse katseklaasi 3 ml tööreaktiivi ja loksutan kohe. Fikseerin reaktsiooni alguse aja ja hoian katseklaase 20 minutit toatemperatuuril.
Seejärel mõõdan spektrofotomeetrilisel meetodil lainepikkusel 410 nm lahuste optilised tihedused .
Kuna kontrollproov andis madala optilise tiheduse näidu, siis lahutan kõikide teiste lahuste optiliste tiheduste väärtustest kontrollproovi optilise tiheduse väärtuse.
Proovi number
Optiline tihedus
1.0-proov
0,0611
2.Õunamahl 1
0,0845-0,0611=0,0234
3.Õunamahl 2
0,0840-0,0611=0,0229
4. Glükoosilahus 0,25 mg/ml
0,1205-0,0611=0,0594
5.Glükoosilahus 0,125 mg/ml
0,0748-0,0611=0,0137
6.Glükoosilahuse 0,062 mg/ml
0,0617-0,0611=0,0006
Koostan kaliibrimisgraafiku
Kuna kaliibrimisgraafik peaks olema linearne ning minu katseandmetega polnud seda kuidagi võimalik saavutada, siis jätan antud koha peal graafiku selliseks , nagu ta on, ning teen arvutused selle graafiku kohaselt, võttes arvesse, et saadud tulemus on suure tõenäosusega ebakorrektne. Selgitused täpsustan järeldustes.
Arvutan siinkohal ära ka uuritava proovi keskmise optilise tiheduse = = 0,02315
Loen graafiku pealt glükoosi umbkaudse kontsentratsiooni C ≈ 0,146 mg/ml
Siit saan arvutada glükoosisisalduse uuritavas lahuses massiprotsentides.
X = C × L × 10-3 × = 0,146 × 100 × 10-3 × = 1,46 %
C – glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses kaliibrimissirge järgi (mg/ml)
L – lahjendustegur
10-3 – tegur üleminekuks grammidele
d – mahla tihedus (g/cm3)
Järeldus
Kaliibrimisgraafik peaks olema antud töös lineaarne, mis minu katseandmete järgi selline ei tulnud. Uurisin paarilt kursusekaaslastelt nende katsetulemusi ja võrdlesin neid enda omaga ning leidsin, et glükoosilahuste lahjenduste optilised tihedused erinesid oluliselt minu omadest. Teen väikese tabeli, võrdlemaks enda optilisi tihedusi kursusekaaslaste omadega.
Lahjendus
Minu tulemus
Ligikaudne tulemus kursusekaaslastel
Glükoosilahus 0,25 mg/ml
~0,06
~0,06-0,07
Glükoosilahus 0,125 mg/ml
~0,01
~0,04-0,05
Glükoosilahus 0,062 mg/ml
0,0006
~0,02
Kuna tegu oli kahekordsete lahjendustega, siis oleks pidanud, sarnaselt kursusekaaslaste tulemustega, optilised tihedused olema omavahel umbes kahekordsete erinevustega. Minu tulemused on omavahel aga palju suuremate erinevustega, mille tõttu normaalset graafikut luua oleks olnudki võimatu. Lisan siia üleval antud tabeli parempoolse veeru järgi tehtud graafiku, illustreerimaks õiget graafikut.
Graafiku mitteväljajoonistumise põhjuseid võis olla mitmeid. Üheks nendest põhjustest võis olla määrdunud küvett, mis segas korrektset optilist tihedust mõõtmast. Kui oleksin osanud koha peal hinnata optiliste tiheduste ligikaudset korrektsust, oleksin teinud kordusmõõtmise, veendumaks, et küvett on puhas ja töökorras.
Teisel juhul võis olla tegu tööreaktiivi vähese aktiivsusega, mille tagajärjel ei tekkinud piisavalt produkte, et tekiks kromogeenne substraat (oleks pidanud ehk kauem seisma?). Viimane põhjus on küll vähetõenäoline, sest sel juhul oleks pidanud ja minuga paralleelselt katset teinud inimeste tulemused olema samamoodi väiksemad, kuid see niiviisi ei olnud.
Minu enda arvamusel võis kõige tõenäolisem põhjus peituda kehvas lahjendamises. Kuna esimese lahjenduse optiline tihedus on sarnane tihedustega, mida mõõtsid kursusekaaslased sama katset läbi viies, siis võib eeldada, et esimene lahjendus on korrektselt läbi viidud . Selle lahjenduse läbiviimisel ei olnudki suurt võimalust eksida, kui juhendit täpselt järgida. Tundub, et mul võis jääda esimene lahus korralikult läbiloksutamata, et kontsentratsioon ühtlustuks, sest teise lahjenduse optiline tihedus on võrreldes kursusekaaslaste omadega ja võrreldes ka esimese lahusega liiga väike. Rääkimata kolmandast lahjendusest, kus optiline tihedus on juba nullilähedane.
Seega võis probleem suure tõenäosusega sisse tulla lahjenduste valmistamisel.
Kuna kunstlikult valmistatud graafik pole täiesti korrektne, siis on kahjuks võimatu arvutada ka hüpoteetilist glükoosisisaldust (graafiku trendline ei anna arvutamiseks paraku päris korrektset valemit).