Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (0)

3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Teooria Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määrmiseks bioloogilistes vedelikes kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb kahe ensüümi ­ glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel . GOx on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes, mis võimaldab meetodit kasutada ka teiste taandavate suhkrute juuresolekul.
GOx katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOx sisaldab flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensüüm. FAD kaasabil kantakse glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit hapnikule, mille tulemusena oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja tekib viimasega ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi.
OH OH
H O OH H O H GOD H OH H + O2 OH H O + H2O 2 HO H (FAD -> FADH2) HO H OH H OH ,D-glükoos O D-glükonolaktoon OH (HOCH) 4 + H2O 2 HO D-glükoonhape
Reaktsiooni järgmises etapis osaleb POx, mis sisaldab prosteetilise rühmana heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). Teine substraat ­ H2O2 toimib seejuures kui vesiniku aktseptor, redutseerudes H2O -ks.
Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses glükoosisisalduses uuritavas proovis.
Reaktsiooni põhimõtteline skeem:
peroksüdaas Oksüdeeritud substraat värvusetu + H2O2 Taandatud substraat + H2O2 värviline
Mugavaks substraadiks, mida siin töös kasutatakse, on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], (kollane veresool ). POx katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] (punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas pH 6 juures.
1 2+ + peroksüdaas 3+ 2Fe + H2O 2 + 2H 2Fe + 2H2O Töö käik Töö toimus ettevalmistatud tööreaktiiviga. 25 ml tööreaktiivi sisaldab: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi 1,5 mg peroksüdaasi 16,6 ml 0,2M fosfaatpuhvrit, pH=6,0 K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni Uuritavaks prooviks oli viinamarja mahl. Marjadest pressiti välja väike kogus mahla ning tehti 250x lahjendus. Selleks võeti 0,4 ml mahla, viidi see 100 ml mõõtkolbi ning täideti kolb kriipsuni destilleeritud veega. Selleks, et glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlaks teha, tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A). Graafiku x- telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (optilise tiheduse) väärtust lainepikkusel 410 nm.
Valmistati kindlakontsentratsioonilised glükoosilahused. Selleks võeti 3 puhast katseklaasi. Esimesse pipeteeriti 2,5 ml glükoosi standardlahust (1 mg/ml) ning 7,5 ml dest.vett ­ saadi 0,25 mg/ml kontsentratsiooniga lahus. Teise pipeteeriti 5 ml 0,25 mg/ml kontsentratsiooniga lahust ning 5 ml vett ­ saadi 0,125 mg/ml konts-ga lahus. Kolmandasse katseklaasi pipeteeriti 5 ml 0,125 mg/ml konts-ga lahust ning 5 ml vett ­ saadi 0,062 mg/ml konts-ga lahus.
Võeti 6 puhast katseklaasi, nummerdati. Katseklaasi nr 1 pipeteeriti 1 ml destilleeritud vett (0- proov ), katseklaasidesse nr 2 ja 3 1 ml uuritavat lahust, katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust. Igasse katseklaasi lisati 3 ml tööreaktiivi, loksutati. Katseklaase hoiti 20 minutit toatemperatuuril. Selle aja möödudes mõõdeti spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm lahuste optiliste tiheduste väärtused.
Tulemused Katseklaasi nr D Korrigeeritud D
1 0,0417 0
2 0,2024* 0,1607*
3 0,2012* 0,1595*
4 0,2368 0,1951
5 0,1628 0,1211
6 0, 1033 0,0616
* Need optilise tiheduse väärtused on saadud lahuse veel 2x lahjendamisel (kokku 500x lahjendus)
2 0,25
0,2
0,15 D
0,1
0,05
0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 [Glyc] mg/ml
Katseklaaside 2 ja 3 keskmine optiline tihedus
Glükoosisisaldus massiprotsentides (X, %) naturaalse mahla suhtes leitakse valemiga:
C ­ glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule ~0,195 mg/ml
L ­ mahla lahjendustegur 500x
d ­ mahla tihedus (g/cm3) 1 g/cm3
Kirjanduse andmetel on viinamarjamahla glükoosisisaldus ~7%. Katse tulemus ei erine sellest väga palju, seega pean katset õnnestunuks.
3