Glükoosi sisalduse määramine ensümaatilisel meetodil. (3)

YKL3312 Biokeemia - praktikum
Laboratoorse töö
nr ja pealkiri
3.5. Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Õpperühm:
YAGB21
Töö teostaja:
Liidia Nazarova
Matriklinumber :
082550
Palun teha parandused.
Tulemus sellega küll oluliselt ei muutu, kuid arvutuskäik peab siiski õige olema.
M.K.
08.03.
Teoreetilised alused.
Glükoosisisaldu määramiseks kasutataske meetodit, mis põhineb kahe ensüümi kasuutamisel. Need on glükoosi oksüdaas (GOD) ja peroksüdaas (POD). GOD kasutamine annab võimalust määrata glükoosi ka teiste suhkrute juuresolekul.
GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. See ensüüm sisaldab flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mille abil glükoosi molekulilt kantakse kaks vesiniku aatomit hapnikule. Tulemusena toimub glükoosi oksüdeerumine glükoonhappeks ja tekib vesinikperoksiid.
Järgmises etappis osaleb POD. See katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist. Teine substraat H2O2 redutseerub, andes vett.
Kasutades substraati, mis oksüdeerub andes värvilist produkti, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Lahuse värvuse intensiivsus on võrdelises sõltuvuses glükoosisisaldusest uuritavas proovis.
Värvilise substraadina kasutatakse kaaliumheksatsüaanoferraati(II), nn kollane veresool . Reaktsiooni käigus Fe2+ oksüdeerub Fe3+-ks, sellega kaasneb H2O2 redutseerumine. Tekib punane veresool, mis annab lahusele kollast värvi, mis on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsiooni teostatakse happelises keskkonnas.
Töö käik. Kasutatakse ennevalmistatus reaktiivi, mille koostisse kuuluvad järgmised ained 25 ml-lises mõõtekolbis:

• 2.5 mg glükoosi oksüdaas
  
• 1.5 mg peroksüdaas
  
• 16,6 ml 0.2M fosfaatpuhver, pH = 6,0
  
• kaaliumheksatsüaanoferraadi(II) 0.1%-line lahus
  

Tundmatu lahuse ettevalmistamine.
Tindmatuks lahuseks on mee lahus. Kaaluklaasis kaalusin 0.11 g mett . Seda viiakse kadudeta 200 ml mahuga mõõtekolbi. Seda tehakse kuuma veega (70-80ºC), klaasi sisu segatakse klaaspulkaga ja valatakse mõõtekolbi lehtri abil. Seejärel 2/3 kolbi täidetakse kuuma veega ja soojendatakse veel 15-20 min veevannis. Pärast jahutatakse ja kontrollitakse lahuse pH (pH ≈ 7) ja siis täideyakse kolv kriipsuni külma dest. veega.
Glükoosilahuse valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks .
Selleks kasutatakse sandartlahuse, millel on kindel kontsentratsioon (C = 1 mg/ml). Sellest võetakse 5 ml ja lahjendatakse 15 ml-ga dest. veega, saades lahuse, mille kontsentratsioon on 0.25 mg/ml.Viimasest lahusest võetakse 5 ml ja lahjendatakse 5 ml dest veega, saades lahuse, mille kontsentratsioon on 0.125 mg/ml. Viimasest lahusest võetakse 5 ml ja lahjendatakse 5 ml dest veega, saades lahuse, mille kontsentratsioon on 0.062 mg/ml.
Reaktsiooni läbiviimine.
Võetakse 6 katseklaasi.
1.-sse pipeteeritakse 1 ml dest. vett.
2.-sse ja 3.-sse 1 ml uuritavat lahust.
4.-sse, 5.-sse ja 6.-sse 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust.
Igasse katseklaasi valatakse 3 ml tööreaktiivi, loksutatakse ja jäetakse 20- ks minutiks reageerima .
Reaktsiooni tulemusena katseklaasides 2-6 tekkis helekollane lahus, mis on tingitud punase veresoola sisaldusega lahuses.
Viimane etapp on lahuste optilise tiheduse määramine spektrofotomeetril lainepikkusel 410 nm.
Kinlda glükoosi kontsentratsiooniga proovide optilise tiheduse tabel ja graafik .
0
0
0,25
0,113
0,125
0,059
0,062
0,029
Tundmatu konstentratsiooniga proovi optilise tihedus: D1 = 0,099, D2 = 0,096, lahutan keskmisest väärtusest 0,03 (esimeses katseklaasis oleva proovi optiline tihedus) ja saan D = 0,0675.
Vastavalt graafikule glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses on 0,149 mg/ml.
Glükoosisisaldus uuritavas proovis arvutatakse järgamise valemi abil:
C – Glükoosi kontsentratsioon uuritavas proovis
V1 – uuritava lahuse üldmaht
L – lahjendustegur
10-3 – tegur üleminekuks grammidele
V2 – värvusreaktsiooni läbiviimiseks võetud uuritava lahuse maht, ml
G – mee kaalutis , g
W – mee niiskusesisaldus , %
Seega glükoosisisaldus mees on 32,64 %.