Glükoosisisalduse määramine (2)

Tallinna Tehnikaülikool
Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Töö nr: 3.5
Nimi: Lona Sarapuu
Kood: 082631
Õpperühm : YAGB21
Juhendaja nimi: Malle Kreen
Tallinn 2009
Sissejuhatus
Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes vedelikes (vereseerumis, piimavadakus jm) kasutatakse ensümaatilist meetodit, see põhineb kahe ensüümi: glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel . See meetod võimaldab määrata glükoosisisaldust ka teiste taandavate suhkrute juuresolekul, tänu GOD-i substraadispetsiifilisusele β,D-glükoosi suhtes.
GOD (süstemaatiline nimetus β,d-glükoos)- O2-oksüdoreduktaas katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD on liitvalk - flavoproteiin, sisaldab prosteetilise grupina (mittevalgulise komponendina) flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensüüm. Glükoosi molekulilt kantakse kaks vesiniku aatomit hapnikule FAD kaasabil ja selle tulemusena oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja tekib viimasega ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi.
Reaktsiooni edasises etapis osaleb POD (süstemaatilise nimetusega doonor : H2O2- oksüdoreduktaas). Samuti on POD koostiselt liitvalk- kromoproteiin, mis sisaldab prosteetilise rühmana heemi. POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). Teine substraat - H2O2 toimib seejuures kui vesiniku aktseptor, redutseerudes H2O-ks. Saab ka kasutada kromatogeenset substraati, st substraati, mille oksüdatsioonil tekib värviline produkt , siis saab reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon (lahuse värvuse intensiivsus) on võrdelises sõltuvuses glükoosisisaldusest uuritavas proovis.
Reaktsiooni skeem:
POD toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina võib kasutada väga erinevaid keemilisi ühendeid. Üheks võimalikuks substraadiks on o-tolidiin, mille helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 639 nm.
Mugavaks substraadiks vaadeldava reaktsiooni jaoks on kaaliumheksatsüano-ferraat (II) K4(Fe(CN)6) ehk kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe 3+-ks. Sellega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks , tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. See reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas.
Selles töös kasutataksegi POD substraadina kaaliumheksatsüanoferraat(II).
Töö käik
Töö eesmärgiks on glükoosisisalduse määramine tundmatus proovis. Selleks kasutatakse tööreaktiivi, mis sisaldab eelpoolnimetatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD), kromatogeenset, st reaktsiooni käigus värviliseks muutuvat substraati kaalium -heksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks ka fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
Töötamine toimub ettevalmistatud tööreaktiiviga.
Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil, selle x- teljel on glükoosi kontsentratsioon lahuses (C, mg/ml) ja y-teljel peale reaktsiooni läbiviimist mõõdetud lahuse optiline tihedus ehk absorptsioon ( tähis D või ABS).
Tööreaktiivi koostis:
Tavaliselt valmistatakse tööreaktiivi 25 ml vastava mahuga mõõtkolvis ja see sisaldab:

• 2,5 mg glükoosi oksüdaasi
  
• 1,5 mg peroksüdaasi
  
• 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH= 6,0
  
• K-heksatsüanoferraat(II) K4(Fe(CN)6) 0,1%-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini.
  

Uuritav proov (tundmatu lahus)
Uuritavaks prooviks ehk tundmatuks lahuseks, milles tuleb glükoosi kontsentratsioon määrata, võib olla:

• Glkoosi vesilahus
  
• Mee lahus
  
• Hele puuviljamahl (viinamarja, õuna vms)
  
• Mõni füsioloogiline lahus ( vereseerum , uriin jne).
  

Minul oli uuritavaks prooviks viinamarja mahl, mille kontsentratsiooni ma pidin määrama.
Tundmatu lahuse ettevalmistamine
Mahl või mõni muu vedelik
Kuna tundmatuks lahuseks osutus mahl , siis 1 ml viinamarjamahlast pidin ma tegema 300 kordse lahjenduse ning sellega viisin läbi värvusreaktsiooni. 300 kordset lahjendust tegin 20 ml.
Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks
Kindla glükoosi kontsentratsiooniga lahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standardlahusest, milles glükoosi kontsentratsioon on täpselt 1,0 mg/ml. Sellest valmistatakse lahjemad glükoosilahused ehk lahjendused.
Lahjendusi tuleb teha standardlahusest kolm lahjendust, milles glükoosi kontsentratsioon on siis 0,25 mg/ml (4 kordne lahjendust), 0,125 mg/ml (8 kordne lahjendust) ja 0,062 mg/ml (16 kordne lahjendus).
Lahjendamise põhimõte: lahjendamiseks võetud lahuse(standardlahuse) mahus ja lahjendatud lahuse lõppmahus sisaldub üks ja sama aine hulk, see tähendab, et kehtib võrrand:
Cst * Vst = Clahj * Vlahj
Võrrandis Cst ja Clahj tähistavad aine kontsentratsiooni vastavalt standard- ja lahjendatud lahuses, Vst ja Vlahj vastavate lahuste mahtusid. See võrrand võimaldab arvutada lahjenduse tegemiseks vajaliku standardlahuse mahu, kui on teada vajalk lahjendatud lahuse maht.
Lahjendusete (lahjendatud glükoosilahuste) valmistamiseks võetakse kolm puhast, kuiva kalibreeritud (jaotusega varustatud) katseklaasi, kuhu pipeti abil mõõdetakse eelnevalt väljaarvutatud kogus glükoosi standardlahust ja lisatakse destilleeritud vett nii palju, kui on vajalik lahuse lõppmahu saavutamiseks( antud juhul on vajalik 20 ml kokku). Katseklaasid suletakse korkidega ja loksutatakse ühtlustamiseks läbi.
Reaktsiooni läbiviimine
Reaktsioon viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuril. Selleks pannakse katseklaaside statiivi 6 puhast ja kuiva katseklaasi. Asjalik on ka katseklaasid markeriga ära märkida. Kontrollkatse, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni, viiakse destilleeritud veega. Uuritava lahusega tehakse kaks paralleelkatset, glükoosi standardlahusest valmistatud lahjendustega igaühega üks katse:

• Katseklaasi nr 1pipeteeritakse 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov)
  
• Katseklaasidesse nr 2 ja 3 pipeteeritakse 1 ml uuritavat lahust (paralleelproovid)
  
• Katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 pipeteeritakse igasse 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust, mis on eelnevalt kirjutatud viisil valmistatud.
  
• Igasse katseklaasi pipeteeritakse 3 ml tööreaktiivi ja loksutatakse kohe, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni.
  
• Kohe peale tööreaktiivi lisamist fikseeritakse aeg ja katseklaase hoitakse 20 minutut toatemperatuuril. ( mina lisasin tööreaktiivi kell 11.17 ja lasin proovidel toatemperatuuril seista kella 11.37-ni).
  
• Spektromeetril mõõtsin lainepikkusel 410 nm lahuste optilised tihedused , kasutades võrdluslahusena destilleeritud vett.
  

Kuna kontrollproov annab teatava madala optilise tiheduse väärtuse, siis tuleb kõikide glükoosilahuste optilise tiheduse väärtusi korrigeerida , lahutades neist kontrollproovi optilise tiheduse väärtuse.
Optilised tihedused:
Optiline tihedus (ABS)
Optilisest tihedusest maha lahutatud kontrollproovi värtus (ABS)
Veega proov
0,057
Proov 1
0,183
0,126
Proov 2
0,188
0,131
4x lahjendus (0,25 mg/ml)
0,157
0,1
8x lahjendus (0,125 mg/ml)
0,103
0,046
16x lahjendus (0,0625 mg/ml)
0,072
0,015
Kaliibrimisgraafik ja arvutused:
6