Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (sidrunimahl) (0)

Töö nr 3.3
Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Koostas:
Juhendaja : Mart Reimund
Teoreetilised alused
Glükoosisisalduse määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel .
GOx on substraadispetsiifiline β,D-glükoosi suhtes ning seetõttu saab selle meetodiga määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel, produktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis moodustab hüdrolüüsides D-glükoonhappe. GOx on liitvalk , mittevalguliseks komponendiks on FAD, mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk.
FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule. Tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.
Ka POx on liitvalk, mittevalguliseks komponendiks on heem, seega on hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronides vesinikperoksiidi, mille redutseerimisel moodustu vesi.
Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati (II) (see on kollane veresool). POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasneb vesinikperoksiidi redutseerumine veeks . Tekib kaaliumheksatsüanoferraat (III) (see on punane veresool), mis annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures.
Minu konkreetne tööülesanne oli glükoosisisalduse määramine sidrunimahlas, POx substraadina kasutasime kaaliumheksatsüanoferraati (II).
Töö käik
Tööreaktiiv
Tööreaktiiv sisaldas 2,5 mg GOx, 1,5 mg POx, 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0 ning ülejäänud 0,1% kaaliumheksatsüanoferraati (II), et täita 25 ml mõõtekolb.
Mina töötasin juba ettevalmistatud tööreaktiiviga.
Uuritava lahuse ettevalmistamine
Minu uuritavaks prooviks oli sidrunimahl .
Pigistasin sidrunist välja väikese koguse mahla, juhendajalt sain juhised lahuse lahjendusmäära osas: tuli võtta 1ml sidrunimahla 25 ml lahuse jaoks.
Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks
Glükoosi kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks sidrunimahlas tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni (x telg ) lahuse optilise tihedusega (y telg) lainepikkusel 410 nm.
Glükoosilahuste valmistamisel lähtusime glükoosi standardlahusest, mille glükoosisisaldus on 1,0 mg/ml. Esmalt tuli sellest valmistada kindel maht (10ml) glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml, seejärel tuli seda lahjendada 2 korda ning saadud lahjendust omakorda 2 korda.
Värvusreaktsiooni läbiviimine
Vaja läheb 6 puhast ja kuiva katseklaasi, katse toimub toatemperatuuril.
Katseklaas nr 1 – pipeteerida 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov)
Katseklaas nr 2 ja 3 – pipeteerida 1 ml uuritavat lahust (2 paralleelproovi)
Katsekaas nr 4, 5 ja 6 – pipeteerida igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust
Igasse pipeteerida 3 ml tööreaktiivi, loksutada , fikseerida aeg ning oodata 20 minutit. Seejärel mõõta lahuste optilise tiheduse väärtused lainepikkusel 410 nm, võrdluslahusena kasutatakse destilleeritud vett.
NB! Ka kontrollproov võib anda madala optilise tiheduse näidu ja seega tuleb kõikidest glükoosis sisaldavate lahuste optilise tiheduse väärtustest lahutada kontrollproovi optilise tiheduse väärtus, nende põhjal koostataksegi kaliibrimisgraafik.
Katseklaas nr 1 - 0,103 A
Katseklaas nr 6 (C=0,062) – 0,119 A
Katseklaas nr 5 (C=0,125) - 0,135 A
Katseklaas nr 4 (C=0,25) - 0,162 A
Katseklaas nr 3 – 0,203 A
Katseklaas nr 2 – 0,205 A
Lahutan maha kontrollproovi optilise tiheduse väärtuse:
Katseklaas nr 1 - 0 A
Katseklaas nr 6 (C=0,062) – 0,016 A
Katseklaas nr 5 (C=0,125) - 0,032 A
Katseklaas nr 4 (C=0,25) - 0,056 A
Katseklaas nr 3 – 0,100 A
Katseklaas nr 2 – 0,102 A
Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine
Kaliibrimisgraafik koostatakse kolme lahjendatud ja kindla kontsentratsiooniga proovide optilise tiheduse väärtuste alusel. Kui katse on korrektselt läbi viidud , peaks graafik endast ette kujutama koordinaatide alguspunkti läbivad sirget. Glükoosi kontsentratsioon leitakse kaliibrimisgraafiku abil paralleelproovide keskmise optilise tiheduse väärtuse järgi.
Paralleelproovide keskmine optilise tiheduse väärtus oli 0,101 A, sellele vastav C on 0,42 mg/ml.
Glükoosisisalduse leidmiseks kasutame mahla puhul valemit:
X= (C * L * 10-3 * 100) / d = (0,42*25*10-3 * 100) / 1 = 1,05 %
C= glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg/ml)
L= lahjendustegur (antud katses minul L=25)
d= mahla tihedus (võib lugeda võrdseks 1-ga)
Järeldus
Kuna kaliibrimissirge osutuski sirgeks , nagu ideaalis vaja oli, siis loen katse õnnestunuks.
Tean, et katse tegemisel tulid ette mõned ebatäpsused koguste mõõtmisel ja paralleelkatsete optilise tiheduse väärtus kõikus samuti, kuna jätsin lahuse filtreerimata. Samas ei oska ma aga vea suurust hinnata, kuna ma ei leidnud Internetist sidrunimahla glükoosisisalduse kohta informatsiooni.