Biokeemia praktikum - Glükoosi sisalduse määramine (0)

Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö nr.3.3
Anna Logunova YAGB-22
103347
Glükoosi sisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Teooria
Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks biologilistes objektides,nagu vereseerum,toiduained,taimne tooraine jm kasutatakse laildaselt ensümaatilist meetodilt,mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel .
Glükoosi oksüdaas katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel.Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja D-glükoonhappe.
Peroksüdaas ktalüüsib spetsifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati,, mille redutseerumisel moodustub vesi.
Pox-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate.Peroksüdaasi reaktsioonil võib kak kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(ll) K4[Fe(CN)6]. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2
redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane
veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm.
Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures.
Töö käik
Tööreaktiiv
Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis
tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi
(POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide
kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse:
2,5 mg glükoosi oksüdaasi;
1,5 mg peroksüdaasi;
16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0;
K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni.
Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril.
Tundmatu proovi ettevalmistamine
Sidruni mahl
50ml katseklaasi valan 1ml filtreeritud sidruni mahla ja lahjendan x50 korda destilleeritud veega.
Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks
Selleks, et glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlaks teha, tuleb esmalt
koostada kaliibrimisgraafik , mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A)
e optilise tihedusega (D) lainepikkusel λ=410 nm. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni
(C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (= optilise tiheduse) väärtust nimetatud
lainepikkusel.
Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi
standard-lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest
valmistatakse kolm lahjemat glükoosilahust ehk lahjendust, reeglina kontsentratsioonidega
0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml.
Cst ⋅ Vst = Clahj ⋅ Vlahj → Vst= Clahj ⋅ Vlahj / Cst
Cst ja Clahj tähistavad aine kontsentratsiooni vastavalt standard- ja lahjendatud
lahuses, Vst ja Vlahj vastavate lahuste mahtusid. Seega võimaldab toodud võrrand arvutada
lahjenduse tegemiseks vajaliku standardlahuse mahu, kui on teada lahjendatud lahuse
vajalik maht (10ml).

Vvesi =10ml-2,5ml=7,5ml

Vvesi =10ml-1,25ml=8,75ml

Vvesi =10ml-0,62ml=9,38ml

Lahjenduste valmistamine
Lahjenduste valmistamiseks võtan 3 puhast,kuiva katseklaasi,kuhu pipeti abil mõõdan eelnevalt väljaarvutatud kogus glükoosi standardlahust. Destilleeritud vett lisan pipetiga niipalju,kui on vajalik lahuse lõppmahu(10ml) saavutamiseks. Katseklaasid sulen korkidega ja loksutan kontsentatsiooni ühtlustamiseks.
Värvusreaktsiooni läbiviimine
Reaktsiooni läbiviimiseks asetan katseklaaside statiivi 6 puhast, kuiva katseklaasi ja numereerin.
Kontrollkatse e 0-proov,mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni,viian läbi destilleeritud veega.
Katseklaasi nr.1 pipeteerin 1ml dest.vett
Katseklaasidesse nr.2,3 pipeteerin 1ml uuritavat lahust(2 paralleelproovi)
Katseklaasidesse nr.4,5,6 pipeteerin igaühte 1ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust.
Igasse katseklaasi pipeteerin 3ml tööreaktiivi ja loksutan kohe,et saavutada ühtlast kontsentratsiooni.
Fikseerin reaktsiooni alguse aeg ja katseklaase hoian 20 minutit toatemperatuuril.Reaktsiooni tulemusena glükoosi sisaldavad lahused värvuvad tekkiva K-heksatsüanoferraat(lll) toimel kollaseks.
20 minuti pärast mõõdan spektrofotomeetriga lainepikkusel 410nm lahuste optilise tiheduse väärtused.
Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine
Katse tulemused:

0-proob 0,059ABS

Uuritav lahus 0,173ABS

Uuritav lahus 0,170ABS

Glükoosi lahus 0,25mg/ml 0,196ABS

Glükoosi lahus 0,125mg/ml 0,130ABS

Glükoosi lahus 0,62mg/ml 0,106ABS
Kaliibrimisgraafik:
Katsetel 2 ja 3 saadud keskmine absorbtsioon
Leiame saadud sirge võrrandi valemiga:
Läbiviidud mõõtmiste alusel sain, et y1=0,170; y2=0,173 ja seega ykesk=0,172.
Konsentratsioon , saadud andmete põhjal, võrdub : .
Internettist: sidruni mahla tihedus d=1,026 g/cm3.
Arvutan glükoosisisaldus massiprotsentides (X,%)
C-glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg/ml)
L-mahla lahjendustegur
d-mahla tihedus
Järeldus: Katse näitas,et absorptsioon kasvab kontsentratsiooni suurendamisel.
Uuritavas lahuses (sidruni mahl) on 1,026% glükoosi.