GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL (2)

GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
Kasutatavad ained
3 viinamarja mahl, tööreaktiiv: Glükoosi oksüdaas(GOD), peroksüdaas(POD), K4[Fe(CN)6] 0,1 % vesilahus , 0,1 M Fosfaatpuhvrit ph 6.
Kemism
Glükoosi lahusele lisati tööreaktiivi, kus sisalduv GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD-is sisalduv flaviinadeniindinukleotiid abil oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja vesinikperoksiidiks. Edasi katalüüsib POD kromogeense substraadi kollase veresoola oksüdeerumist. POD-i toimel oksüdeerub kollases vere soolas sisalduv Fe+2 Fe+3-ks., millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv punane veresool annab lahusele hele kollaka värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm.
Töökäik
Kolmest etteantud viinamarjast uhmerdati välja 1ml klaari mahla. Saadud mahl lahjendati destileeritud veega 250 ml-ni.
Õppejõult saadud glükoosi lahusest tehti kolm 4 kordset lahjendust. Esimesse katseklaasi pipeteeriti 2,5 ml glükoosi lahust ja 7,5 ml destileeritud vett.Teise katseklaasi pipeteeriti eelmisest katseklaasist 5ml lahust ja 5ml destileeritud vett. Kolmandasse katseklaasi pipeteeriti teisest katseklaasist 5 ml lahust ja 5ml destileeritud vett.
Statiivile asetati 6 puhast katseklaasi ja nummerdati need:

• Nr 1 1ml destileeritud vett + 3 ml tööreaktiivi
  
• Nr2 ja Nr3 1ml viinamarjamahla lahust + 3 ml tööreaktiivi
  
• Nr4 , Nr5 ja Nr6 1ml erineva lahjendusega glükoosi lahust + 3 ml tööreaktiivi
  

Katseklaaside sisu loksutati segamini ja lasti seista 20 minutit. Lahused värvusid õrnalt kollaseks.
Pärast seismist mõõdetakse spektrofotomeetril lainepikkusel 410 nm lahuste optilise tiheduse väärtused, kasutades võrdluslahusena destileeritud vett.
Katse tulemused

• Nr1 destileeritud vesi 0,052 ABS
  
• Nr2 viinamarjamahl 0,152 ABS – 0,052 ABS = 0,1 ABS
  
• Nr3 viinamarjamahl 0,153 ABS – 0,052 ABS = 0,101 ABS
  
• Nr4 esimene lahjendus 0,169 ABS – 0,052 ABS = 0,117 ABS
  
• Nr5 teine lahjendus 0,110 ABS – 0,052 ABS = 0,058 ABS
  
• Nr6 kolmas lahjendus 0,083 ABS – 0,052 ABS = 0,031 ABS
  

• Nr4 konsentratsioon on 2,5/10 = 0,25 mg/ml
  
• Nr5 konsentartsioon on 1,25/10 = 0,125 mg/ml
  
• Nr6 konsentratsioon on 0,625/10 = 0,0625 mg/ml
  

Paralleelproovide keskmine optiline tihedus on (0,1+0,101) / 2 = 0,1005 ABS. Kaliibrimisgraafiku järgi on viinamarjamahla lahuse kontsentratsioon 0,215 mg/ml.
Lahjendustegur on (1+249)/1=250.
Algmahla kontsentratsiooni on 0,215 mg/ml x 250ml = 53,75 mg/ml.
53,75 mg ainet sisaldub 1ml mahlas . Kui glükoosi tihedus on 1,54 g/ml, mis teeb 1540 mg/ml, siis sisaldub 53,75 mg :1540 mg/ml = 0,03 ml glükoosi 1ml mahlas. Järelikult on 1 ml mahlas 3% glükoosi.
Järeldused
Rohelised ja punased viinamarjad peaksid sisaldama kuskil 7 % glükoosi. Minu katse tulemuseks oli 3 % glükoosi. Glükoosi sisaldus erinevus võib tulla viinamarjade küpsus astmest ja katseteks võetud lahuste mahu täpsusest.