TTÜ Biokeemia praktikum: Glükoos (0)

TÖÖ 3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL

Juhendajad:
Kaia Kukk
Priit Eek
Teooria
Glükoosisisalduse määramiseks kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel . Tänu GOx-i substraadispetsiifilsusele β-D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul.
GOx-i süstemaatiline nimetus β-D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas näitab, et ta katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Produktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe.
GOx kujutab endast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx on dimeerne valk.
FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab molekulaarsele hapnikule, mille tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.
Järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor :H2O2-oksüdoreduktaas. POx on liitvalk , mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo - ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina H2O2, mille redutseerumisel tekib H2O.
POx-i reaktsiooni saab hõlpsasti jälgida, kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt . Värvilise ühendi kontsentratsioon ehk värvuse intensiivsus on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.
POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt. O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Võib kasutada ka kaaliumheksatsüanoferraati(II), mis oksüdeerudes annab lahusele kollase värvuse (Fe2+→Fe3+) ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures.
Töö käik
Eelnevalt valmistatakse tööreaktiiv (25 ml):

• 2,5 mg glükoosi oksüdaasi
  
• 1,5 mg peroksüdaasi
  
• 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0
  
• K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni
  

Uuritava lahuse ettevalmistamine

• Prooviks kasutatakse pressitud apelsinimahla
  
• Lahuseks võetakse 0,5 ml mahla, pipeteeritakse see 200ml mõõtekolbi ja täidetakse jooneni destilleeritud veega (400x lahjendus).
  
• Mahlalahusest eemaldatakse filtrimise teel viljaliha .
  

Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks . Koostatakse kaliibrimisgraafik , mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga ehk optilise tihedusega 410 nm juures.

• Võetakse 1,0 mg/ml glükoosi lahus
  
• Valmistatakse sellest 3 eri kontsentratsiooniga lahust destilleeritud vees: 0,25; 0,125 ja 0,062 mg/ml
  

Värvusreaktsiooni läbiviimine

• Reaktsioon viiakse läbi toatemperatuuril
  
• Võetakse 6 kuiva katseklaasi, nummerdatakse
  
• Katseklaasi 1 pipeteeritakse 1 ml dest. vett (kontrollproov)
  
• Katseklaasidesse 2 ja 3 pipeteeritakse 1 ml uuritavat mahlalahust (2 paralleelproovi)
  
• Katseklaasidesse 4, 5 ja 6 pipeteeritakse 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust
  
• Igasse katseklaasi pipeteeritakse 3 ml tööreaktiivi ja loksutatakse kohe
  
• Katseklaase hoitakse 20 min toatemperatuuril
  
• Lainepikkusel 410 nm mõõdetakse lahuste optilise tiheduse väärtused
  

Koostatakse kaliibrimisgraafik ja tehakse kindlaks glükoosi kontsentratsioon
Paralleelproovide optilised tihedused : 0,086 ja 0,087, keskmine on 0,0865.
Massiprotsent arvestades 400x lahjendust:
Järeldus: Erinevates allikates on apelsini glükoosisisaldus vahemikus 2% - 8%, seega võib eeldada, et katse tulemused on rahuldavad. Kasutatud apelsini glükoosisisaldus on 4,75 grammi glükoosi 100 grammi mahla kohta.
Allikad:
http://thepaleodiet.com/fruits-and-sugars/
http://www.aqua-calc.com/page/density-table/substance/orange-blank-juice-coma-and-blank-canned-coma-and-blank-unsweetened
http://www.diabetesincontrol.com/index.php?option=com_content&view=article&id=4486
https://www.google.ee/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=6&ved=0CF4QFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.merckmillipore.com%2Fchemicals%2Fen_US%2FMerck-International-Site%2FUSD%2FViewProductDocuments-File%3FProductSKU%3DMDA_CHEM-116136%26DocumentType%3DAPPL%26DocumentId%3D200807.002.Appl%26DocumentSource%3DGINAPPL&ei=ea52UZjcMsXT0QWjkID4Cg&usg=AFQjCNGUBf-8I9PMy5J-zTMbkWuKYNvRnQ&sig2=eWAQ9peYPzZdXYqJT8y5uA&bvm=bv.45512109,d.d2k&cad=rja