KAROTENOIDID JA LIPIIDIDE REAKTSIOONID (3)

TTÜ keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0060 Biokeemia
Laboratoorne töö nr: Töö pealkiri: 2.5 ja 1.3 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE ja LIPIIDIDE REAKTSIOONID
Õpperühm: Töö teostaja : YAGB22 MIHKEL HEINMAA
Õppejõud: Töö teostatud: Protokoll esitatud: MALLE KREEN 15/03/2010 29/03/2010
2.3 ­ arvest. 1.3 ­ parandada. M.K. 28.03. KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE Arvest 28.03. M. K. (2.5.)
TEOORIA
Taimede fotosünteesivate kudede rakud sisaldavad fotosünteesi põhipigmente ­ klorofülle ja abipigmente ­ karotenoide ja fikobiliine, mis on kas kollased , punased või purpursed.
Karotenoidid on loomsetes organismides vitamiin A provitamiiniks (eelühendiks). Enamus toiduga seedekulglasse sattunud karotenoididest allub soole mikrofloora poolt produtseeritava ensüümi karoteeni oksügenaasi toimele ja neist moodustub vitamiin A.
Karoteeni -, - ja -isomeeridest omab suurimat tähtsust - karoteen (punakasoranz), mille molekul loomorganismis poolestub, andes 2 retinooli ehk vitamiin A1 molekuli.
o -karoteen on kristalliline aine sulamistemperatuuriga 183-184 C, mis vees ei lahustu. Etanoolis lahustub karoteen piiratus ulatuses, kuid lahustub hästi apolaarsetes orgaanilistes lahustites . Optilist aktiivsust - karoteen ei oma.
Hulgaliste konjugeeritud kaksiksidemete tõttu neelab -karoteen valgust spektri nähtavas osas. Seetõttu saab karoteeni sisaldust uuritavas materjalis objektiivselt iseloomustada neeldumisspektri järgi. Puhtal karoteenil on apolaarsetes lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri sinises piirkonnas 450 ja 480 nm juures.
Töö eesmärgiks oli taimsetest materjalidest eraldatud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel uuritava materjali karotenoidse koostise iseloomustamine ja -karoteeni sisalduse määramine uuritavas proovis.
TÖÖ KÄIK
Toores punane paprika peenestati ning võeti materjali 0,9 g. Lõplikuks peenestamiseks hõõruti väljakaalutud proov uhmris vähese pestud liiva lisandiga, kuni saavutati ühtlane mass. Lisati sinnasamasse vastavalt vajadusele (segu täieliku kuivendumiseni) veevaba Na 2SO4 , et siduda vett ja jätkati massi hõõrumist. Järgnes karotenoidide ekstraktsioon petrooleetriga ja ekstrakti filtrimine . Lahustit lisati segule umbes 15 ml ja segati. Filtreeriti. Korrati ekstraktsiooni ka teist korda, siis saavutati pea-aegu värvitu ekstrakt . Nüüd uuriti ekstrakti spektromeetril. Spekter mõõdeti lainepikkustel 350-600 nm.
TULEMUSED
Neeldumisspekter ja selle analüüs
Neeldumismaksimumid: 1) 500 nm; D=0,128 2) 469 nm; D=0,209 3) 447 nm; D=0,189
Kirjanduse alusel domineerib lahuses lükopeen (505; 472; 446).
Karoteeni kvanitatiivne määramine Mõõdeti ühendatud ekstrakti optiline tihedus spektrofotomeetril lainepikkusel 469 nm.
D ­ ekstrakti optiline tihedus - 1% lükopeeni lahuse ekstinktsioon (optiline tihedus) lainepikkusel 450 nm. V ­ ekstrakti kogumaht , ml 3 d ­ ekstrahendi tihedus, g/cm g ­ uuritava proovi mass, g 3 10 ­ tegur üleminekuks milligrammidele. LIPIIDIDE REAKTSIOONID Vajab parandamist 28.03. M.K. (1.3.)
01 Rasvapleki proov Teooria: kõigi lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites. Lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk , millest paberi läbipaistvus suureneb. Rasvaplekk on vastu valget vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam. Töö käik: kahte katseklaasi pandi 1g kummastki tahke aine proovist. Mõlemasse katseklaasi valati umbes 1 ml orgaanilist lahustit (atsetooni). Loksutati ja lasti 5 min sesita. Mõlemast katseklaasist kanti pipetiga tilk tahke materjalikohal olevat lahust paberile ja kuivatati. Tulemus: Proovi nr 2 sisaldava lahuse plekk paistis vastu valgust heledam ja vastu varju tumedam. Proovi nr 1 sisaldava lahuse pleki kohalt muutusi läbipaistvuse osas polnud. Seega sisaldas 2. proov lipiide.
02 Akroleiinproov Teooria: glütserooli kuumutamisel, eriti vett siduvate ainete juuresolekul, tekib terava lõhnaga küllastamata aldehüüd propenaal ( akroleiin ). Sama reaktsiooni annavad rasvad ja glütserofosfatiidid, kuid ei anna glütserooli mittesisaldavad lipiidid .
Töö käik: kuiva katseklaasi kanti 1g NaHSO4 ja lisati mõni tilk taimeõli. Kuumutati põletil tõmbekapis soola sulamise ja reaktsioonisegu tumenemiseni. Eralduvat lõhna nuusutati ettevaatlikult. Tulemus: eraldus vänge lõhn, seega sisaldab taimeõli glütserooli.
03 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides Teooria: küllastumata rasvhapete sisaldumise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse analoogiliselt süsivesinike uurimisega reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus lahjeneb, küllastumata rasvhapete puhul aga muutub lahus toimuva liitumisreaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks
Töö käik: kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valati 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis: palmithape , searasv ; oliivõli. Kõigisse katsklaasi lisati tilkhaaval 10 tilka broomi lahust metüleenkloriidis ning jälgiti toimunud muutusi. Tulemus: Palmithappe lahus on ühtlaselt punane, seega /sisaldab või on ise?? see küllastunud rasvhapeid./ on palmithape küllastunud rasvhape . Searasva ja oliivõli lahus puhul tekkis põhja õrn roosakas - kollane kiht (kusjuures searasval tumedam), mis hiljem kadus . /Seega on need küllastunud ravhappeid sisaldavad. Tegelikult?? / Seega ei sisalda nad küllastunud rasvhappeid.
04 Liebermann -Burchard'i kolesterooli määramise test Teooria: happelises keskkonnas moodustub kolesterooli reaktsioonil happe anhüdriidiga iseloomulik rohelise värvusega reaktsiooniprodukt. Olenevalt kolesterooli sisaldusest proovis võib roheline värv tekkida ka üle sinise ja punase vaheühendi.
Töö käik: kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valati 2 ml vastava lipiidi lahust metüleenkloriidis ­ kollesteroolilahus, rapsiõli ning searasva triglütseriid. Igasse katseklaasi lisati 12 tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ning 6 /ml tõesti??/ tilka kontsentreeritud väävelhapet ning segati hoolikalt. Jälgiti toimuvaid muutusi. Tulemus: Kollesterooli lahus muutus tumedaks, sinakas-rohekaks ­ sisaldab kollesterooli (palju). Searasva lahuses muutusi ei toimunud ­ kollesterool puudub. Rapsiõli lahus tõmbus väga hele rohekas -siniseks ­ taimset sterooli (ilmselt /kolesterooli NB! Loomne sterool!! Aga mis sisaldub taimedes?/
stigmasterool, mida peaks rapsiõlis rohkesti leiduma) on, aga vähe.