Laboratoorne töö 1.3 ja 2.3 (1)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
KEEMIAINSTITUUT
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL3312 Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö
1. Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega
1.3 Lipiidide reaktsioonid
2. Segude lahutamine ja ainete identifitseerimine
2.3 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Tallinn 2010
2.3 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE
Karotenoidid on fotosünteesi abipigmendid taimedes, mis on kas kollased , punased või purpursed. Karotenoidid on loomsetes organismides vitamiin A provitamiiniks ehk eelühendiks. Karoteeni alfa, beeta ja gamma isomeeridest omab suurimat tähtsust beeta- karoteen , mis on punakasoranži värvusega isoprenoidne ühend, mille molekul loomorganismis poolestub, andes kaks retinooli, ehk vitamiin A molekuli.
Lõhustumispunkt
-karoteen
Retinool
Beeta- karoteen on kristalliline aine, sulamistemperatuuriga 183-184,mis lahustub apolaarsetes orgaanilistes lahustites ( nt dietüüleeter, tsüklilised alkaanid, petrooleeter jne). Karoteeni molekul sisaldab hulgaliselt kaksiksidemeid ja tänu sellele neelab ta valgust spektri nähtavas osas. Sellepärast on võimalik iseloomustada karoteeni sisaldust proovis neeldumisspektri järgi. Puhtal karoteenil on orgaanilises lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri sinises piirkonnas 450 ja 480nm juures. Antud töö eesmärgiks on taimsetest materjalidest eraldatud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle aluses uuritava materjali karotenoidse koostise iseloomustamine .
Töö käik: Uuritavaks taimseks materjaliks oli paprikas. Eelnevalt noaga peenestatud paprika kaalusin ja kaalutis oli 0,48g. Lõplikuks peenestamiseks hõõrusin uhmris nuiaga vähese pestud liivaga kuni ühtlase massi saavutamiseni. Seejärel lisasin sinna üksikute portsjonite kaupa veevaba
kuni saavutasin ühtlase pulbri , mis oli roosaka värvusega. Sellele järgnes karotenoidide ekstraktsioon sobiva orgaanilise lahustiga, milleks kasutasin petrooleetrit tihedusega 0,69. Ekstrakti valasin läbi filter paberist lehtri mensuuri . Ekstraheerida tuli mitu korda kuna uurisin karotenoide kvantitatiivselt. Alguses oli raske ekstrakti kätte saada, kuna lisasin vist liiga vähe petrooleetrit. Lõpuks hakkasin veidike rohkem petrooleetrit panema ja sain ekstrakti paremini kätte. Lisasin seni kaua, kuni ekstrakt muutus läbipaistvaks. Eelviimane kord lisasin õppejõu sõnul liiga palju petrooleetrit, millest tuleneb ka vähene karoteeni sisaldus paprikas. Ekstrakti mõõtsin mensuuris ära ja mahuks sain 7 ml. Järgmiseks võtsin ekstrakti neeldumisspektri spektrofotomeetris, võrdluslahusena kasutasin puhast petrooleetrit. Lainepikkuseks 400-600nm.
Spektrite lainepikkused ja optilised tihedused
504,0nm; 0,213 A
470,0nm; 0,377 A
447,0nm; 0,348 A
Kirjanduse alusel leidsin, et need lainepikkused sarnanevad kõige rohkem karoteen lükopeeniga:
Arvutusvalemites kasutan tihedust 0,377, sest sellele vastav lainepikkus on kõige lähemal 476nm, vastav E=3450 1%/1cm.
Lükopeeni sisalduse paprikas arvutan valemiga:
, kus
D on ekstrakti optiline tihedus: 0,377A
E on karoteeni lahuse ekstinktsioon lainepikkusel 476nm: 3450
V on ekstrakti kogu maht: 7ml
d on ekstrahendi tihedus: 0,69g/cm3
on tegur üleminekuks milligrammile
g on uuritava proovi mass: 0,48g
Pannes arvud valemisse sain:
Kokkuvõte: Karoteenid on fotosünteesil täiendavateks kiirguse retseptoriteks. Lahustuvad hästi apolaarsetes lahustites. Paprika sisaldab kõige rohkem karoteen lükopeeni.
1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID
Lipiidide rühma kuuluvad ained on enamasti estrid. Lipiidid lahustuvad orgaanilistes solventides, teistes lipiidides ning leelismetallide soolade lahustes. Lipiidide vees lahustumatus tuleneb hüdrofoobsete aatomirühmade ja radikaalide sisaldusest. Lipiide saab vastavalt molekulide ehitusele rühmitada mitmeti ( rasvhapped , vahad, steroidid jne). Lipiidid täidavad organismis mitmesuguseid funktsioone olles nii energia allikas kui ka varuaineks ja kuuluvad ka rakumembraani koostisesse.
Rasvapleki proov : Uurisin kahte tahket materjali, millest üks sisaldas lipiide.
Töö käik: Kahte katseklaasi panin umbes 1g kummastki tahke aine proovist. Mõlemasse katseklaasi valasin umbes 1ml orgaanilist lahustit, loksutasin ja lasin viis minutit seista. Võtsin klaaspulgaga mõlemast katseklaasist proovi ja kandsin paberile, millel lasin kuivada. Alguses ma rasvaplekki ei märganud kummgi paberi peal. Kordasin katset ja seejärel ilmus paberile, mille proov sisaldas lipiide ehk proov B, õrn rasvaplekk.
Järeldus: Lipiide sisaldav proov lahustus orgaanilises lahustis . Paberile moodustub lipiide sisaldava proovi korral rasvaplekk, mis suurendab paberi läbipaistvust. Vastu valget vaadates on see muust paberist heledam ja vastu tumedat vaadates tumedam .
Akroleiinproov: Glütserooli kuumutamisel vett siduvate ainetega tekib terava lõhnaga aldehüüd akroleiin. Seda reaktsiooni ei anna glütserooli mitte sisaldavad lipiidid. Võimaldab otsustada, kas antud proov sisaldab glütserooli või mitte.
Töö käik: Kuiva katseklaasi valasin 1g NaHSO4 ja lisasin 3 tilka oliiviõli. Kuumutasin põletil soola sulamiseni. Tekkis ebameeldiv lõhn, mis oli nagu kõrbe lõhn.
Järeldus: Kuna tekkis terav lõhn, siis järelikult antud proov sisaldas glütserooli sisaldavaid lipiide. Terav lõhn tuli tekkivast akroleiinist.
Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides: Küllastumata rasvhapete kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse reaksiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga sellele iseloomulik pruun värvus lahjeneb, küllastumata rasvhapete puhul aga muutub lahus toimuva liitumisreaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töö käik: Kolme katseklaasi valasin 2ml erineva lipiidi lahust: Palmithape, searasv ja oliiviõli. Kõigisse katseklaasidesse lisasin tilkhaaval 10 tilka broomi lahust. Palmithappe lahus värvus oranžikaks. Oliiviõli lahus oli täiesti läbipaistev.
Järeldus: kuna oliiviõli lahus oli täiesti läbipaistev, tähendab, et ta sisaldas kõige rohkem kaksiksidemeid.
Liebermann - Burchard’i kolesterooli määramise test: Happelises keskkonnas moodustub kolesterooli reaktsioonil happe anhüdriidiga iseloomulik rohelise värvuse reaktsiooniprodukt.
Töö käik: Kolme katseklaasi valasin 2 ml lipiidi lahust, vastavalt kolesterool , rapsiõli ja searasv. Igasse katseklaasi lisasin 10 tilka äädikhappe anhüdriidi ning 4 tilka kontsentreeritud väävelhapet ning segasin. Kolesterooli lahus muutus sinakaks, rapsiõli lahus oli väga õrnalt rohekas . Searasv jäi läbipaistvaks.
Järeldus: Rapsiõli lahus võis sisaldada taimseid steroole.