Leidsid 33 sarnast õppematerjali, mis on seotud failiga "3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil - Biokeemia labori protokoll". Need materjalid aitavad sul teemat sügavamalt mõista.
katseklaas, proov, glükoosisisaldusidrunimahl, reaktsioon, kaliibrimisgraafik, glükoosisisalduseidrunimahlatandardlahus, peroksüdaasiubstraati, kontsentratsiooniga, kasutasin, liitvalk, doonor, veresool, mahus, proovide, telg, biokeemia, protokoll, teoreetilised, kasutamisel, glükoosisisaldustuhkrute, etapis, rõika, hemo, kromoproteiin134537KATB Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele β, D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juureolekul. GO x katalüüsib glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel. GO x on liitvalk e flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniinnukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Vaadeldava meetodi järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika
3. Biokatalüüs 3.3 Glükoosi sisalduse määramine ensümaatilisel moel Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides (vereseerum, toiduained, taimne tooraine jms) kasutatakse ensüüme glükoosi oksüdaas (GOx) ja peroksüdaas (POx). 3.3.1. Töö teoreetilised alused 3.3.1.1 Glükoosi oksüdaas Struktuur: - Liitvalk ehk konjugeeritud valk (flavoproteiin) - Sisaldab koeensüümina toimivat mittevalgulist komponenti FAD-i - Molekul on dimeerne valk
mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk (kaks subühikut). Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. POx on samuti koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (=dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O. Kasutades substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat) saab POx-i reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi
dimeerne valk. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad. FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerides FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükooshapet ja vesinikperoksiidi. Järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna esindajat, rõika peroksüdaasi (EC 1.11.1.7), mille süstemaatiline nimetus on doonor:H 2O2-oksüreduktaas. Pox on samuti liitvalk, mille mittevalguline komponent on heem, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerimisel moodustub vesi. Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat), saab POx-i reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Lahuse värvuse intensiivsus on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.
mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. GOx on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes ning seetõttu saab selle meetodiga määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel, produktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis moodustab hüdrolüüsides D-glükoonhappe. GOx on liitvalk, mittevalguliseks komponendiks on FAD, mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk. FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerudes FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule. Tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Ka POx on liitvalk, mittevalguliseks komponendiks on heem, seega on hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades
Värvusetu Värviline Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 reedutseerimine H2O-ks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6], ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH=6 juures. Peroksüdaas 2+ 2 Fe + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Töö käik: Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme GOx ja POx, kromogeenset substraadi K4[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
Kui kasutatakse substraadi, mille oksüdeerimisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektofotomeetriliselt. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine: Taandatud substraat + H2O2 Oksüdeeritud substaat + 2 H2O POx-i toimel oksüdeeruva kromgeense substraadina kasutatakse bensidiini derivaate. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat (III), K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusele 410 nm. Reaktsioon kulgeb PO x-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. 2 Fe2+ +H2O2 + 2H+ 2 Fe 3+ +2 H2O Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on olulisene koht tööreaktiivil, mis sisaldab Gox, Pox, kaaliumheksatsüanoferraati (II) ja fosfaatpuhvrit pH 6. Tööreaktiiv oli valmistatud praktikumi juhendaja poolt. Tundmatu lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine
04.2012 09.05.2012 arvestatud: Teooria Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse tihti ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. Meetod võimaldab määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul, sest GOx on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes. GOx kujutab endast liitvalku, mis sisaldab FAD-i. Ka POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist. Pox-i reaktsiooni on hõlbus jälgida spektrofotomeetriliselt, kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt. Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise juures on olulisel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab glükoosi osüdaasi ja peroksüdaasi, , kaaliumheksatsüanoferraati(II) ning fosfaatpuhvrit (pH=6,0).
GOx-i molekul on dimeerne valk.FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Tekib ekvimolaarses koguses D- glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Järgmises etapis kasutatakse rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. POx on sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. See tähendab, et ka POx on liitvalk. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide dehüdreerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O. POx-i reaktsiooni saab hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt, kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni põhimõtteline skeem:
uuritava proovi glükoosisisaldusest. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid erinevaid orgaanilisi ühendeid. Lisaks orgaanilistele ühenditele võib substraadina kasutada K4[Fe(CN)6] (kollane veresool). POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt vesinikperoksiid redutseerub veeks. Tekkiv K3[Fe(CN)6] (punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeriv lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik: Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, milleks mina kasutasin mett. Selleks kasutasin tööreaktiivi, mis sisaldas eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi ja peroksüdaasi ja kromogeenset substraati K4[Fe(CN)6]. Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritava lahusena, milles glükoosi kontsentratsiooni määrama hakkasin, kasutasin mina mee tõmmist
K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Tundmatu proovi ettevalmistamine Sidruni mahl 50ml katseklaasi valan 1ml filtreeritud sidruni mahla ja lahjendan x50 korda destilleeritud veega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Selleks, et glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlaks teha, tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel =410 nm. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (= optilise tiheduse) väärtust nimetatud lainepikkusel. Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standard-lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest
joonisel on eritooniliste siniste värvustega näidatud). Roosaga on joonisel näidatud FAD-i molekulid. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad, mis on tähistatud rohelisega. Glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit seob FAD, redutseerides -ks ja kannab need molekulaarsele hapnikule, mis on lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Ka peroksüdaas on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. Peroksüdaas katalüüsib spetsiifiliste substraatide (elektronide doonorite) oksüdeerumist (ehk dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina vesinikperoksiidi, mille redutseerumisel moodustub vesi. Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat), siis saab peroksüdaasi reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt.
oksüdaasi ja peroksüdaasi kasutamisel. Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele ,D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel, reaktsiooniproduktideks vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. GOx on liitvalk, flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise osana flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D- glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Selle meetodi järgmises etapis kasutatakse rõika peroksüdaasi, mis on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise osana heemi
Kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate nagu näiteks diaminobensidiin, tetrametüülbensidiin, samuti 2-tolidiin jt. Antud töös kasutatakse substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II) (K 4[Fe(CN)6]) ehk kollast veresoola. POx katalüüsib raud(II) raud(III)-ks ja vesinikperoksiid redutseerub veeks. Kaaliumheksatsüanoferraat(III) (K3[Fe(CN)6]) ehk punane veresool anna lahusele kollase värvuse, mis on dekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik Tööreaktiiv on eelnevalt juba valmis tehtud, seega alustan tööd uuritava lahuse ettevalmistamisest. Kuna minu valitud uuritav aine on õunamahl, siis juhendaja näpunäidete järgi teen sellest 100-kordse lahjenduse. Selleks võtan 1 ml mahla ja pipeteerin selle 100 ml mõõtkolbi ning kolvi destilleeritud veega kuni märgini. Segan lahuse korralikult läbi. Et glükoosi kontsentratsiooni proovis kindlaks teha, tuleb koostada kaliibrimisgraafik
.......................................... 5 Meloni lahuse ettevalmistamine.......................................................................5 Glükoosilahuste valmistamine..........................................................................5 Värvusreaktsiooni läbiviimine...........................................................................6 Katse andmed..................................................................................................... 7 Kaliibrimisgraafik................................................................................................. 7 Arvutused............................................................................................................ 7 Järeldused............................................................................................................... 8 Kasutatud kirjandus................................................................................................ 9 Sissejuhatus Laboratoorse töö 3
on detekteeritav lainepikkusel 639 nm. Mugavaks substraadiks vaadeldava reaktsiooni jaoks on kaaliumheksatsüano-ferraat (II) K4(Fe(CN)6) ehk kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe 3+- ks. Sellega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks, tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. See reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Selles töös kasutataksegi POD substraadina kaaliumheksatsüanoferraat(II). 3 Töö käik Töö eesmärgiks on glükoosisisalduse määramine tundmatus proovis. Selleks kasutatakse tööreaktiivi, mis sisaldab eelpoolnimetatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD), kromatogeenset, st reaktsiooni käigus värviliseks muutuvat substraati
See meetod võimaldab määrata glükoosi ka teiste teendavate suhkrute juuresolekul. Glükoosi oksüdaas katalüüsib glükoosi oksüdeerumist hapniku toimel glükohappeks. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Peroksüdaas on koostisest ka liitvalk ja selle toimel leiab aset spetsiifiliste substraatide oksüdeerumine H2O2-lt pärineva hapniku abil. Oksüdeerides, mõned substraadid anaavad värvilisi produkte. Siis saab kasutada spektrofotomeetri ning jälgida värviliste ühendite kontsentratsiooni, mis on võrdilises sõltuvuses glükoosisisaldusest. Peroksüdaas Oksüdeeritud substraat + H2O2 Taandatud substraat + 2 H2O Värvusetu Värviline
hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. GOx kujutab endast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. Vaadeldava meetodi järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor: H2O2 oksüdoreduktaas. POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide (elektronide doonorite) oksüdeerumist (= dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O. Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi
ensümaatilist meetodit. See põhineb kahe ensüümi glükoos oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel. · GOD on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes (tänu sellele võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust teiste taandavate suhkrute juuresolekul). · GOD (,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas) katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD on liitvalk (flavoproteiin) ja sisaldab prosteetilise grupina (mittevalguline komponent) flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensüüm. · FADi abil kantakse glükoosi molekulilt kaks H aatomit hapnikule, selle tulemusel glükoos oksüdeerub glükoonhappeks ja tekib FADiga ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. · POD (doonor, H2O2-oksüdoreduktaas) osaleb reaktsiooni järgmises etapis. POD on
komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx on dimeerne valk. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab molekulaarsele hapnikule, mille tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. POx on liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina H2O2, mille redutseerumisel tekib H2O. POx-i reaktsiooni saab hõlpsasti jälgida, kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt. Värvilise ühendi kontsentratsioon ehk värvuse intensiivsus on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.
Bioloogilistes vedelikes kasutatakse glükoosisisalduse määramiseks enamasti ensümaatilist meetodit. See põhineb kahe ensüümi glükoos oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel. GOD on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes (tänu sellele võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust teiste taandavate suhkrute juuresolekul). GOD (,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas) katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD on liitvalk (flavoproteiin) ja sisaldab prosteetilise grupina (mittevalguline komponent) flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensüüm. FADi abil kantakse glükoosi molekulilt kaks H aatomit hapnikule, selle tulemusel glükoos oksüdeerub glükoonhappeks ja tekib FADiga ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. POD (doonor, H2O2-oksüdoreduktaas) osaleb reaktsiooni järgmises etapis. POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem.
värviline Mugavaks substraadiks, mida siin töös kasutatakse, on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], (kollane veresool). POx katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] (punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas pH 6 juures. 1 2+ + peroksüdaas 3+ 2Fe + H2O 2 + 2H 2Fe + 2H2O Töö käik Töö toimus ettevalmistatud tööreaktiiviga. 25 ml tööreaktiivi sisaldab: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi 1,5 mg peroksüdaasi 16,6 ml 0,2M fosfaatpuhvrit, pH=6,0
Teooria Bioloogilistes vedelikes kasutatakse glükoosisisalduse määramiseks enamasti ensümaatilist meetodit. See põhineb kahe ensüümi glükoos oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel. GOD on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes (tänu sellele võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust teiste taandavate suhkrute juuresolekul). GOD (,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas) katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD on liitvalk (flavoproteiin) ja sisaldab prosteetilise grupina (mittevalguline komponent) flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensüüm. FADi abil kantakse glükoosi molekulilt kaks H aatomit hapnikule, selle tulemusel glükoos oksüdeerub glükoonhappeks ja tekib FADiga ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. POD (doonor, H2O2-oksüdoreduktaas) osaleb reaktsiooni järgmises etapis. POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem.
Biokeeemia laboratoorne töö No 2 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil. Õpperühm: YAGB21 Töö teostaja: Alexander Kirichuk Õppejõud: Tiina Randla Õppejõude märkused: Glükoosi sisalduse määrmine. Kas kasutasite korrigeeritud optilise tiheduse väärtusi, millest on kontrollproovi OD maha arvatud? Sellisel juhul peaks graafikul olema koordinaatide alguspunkti läbiv sirge. St et taas tuleb kasutada matemaatilisi manipulatsioone ning punktiparvest too sirge läbi tõmmata. Edasi tuleb uuritava materjali glükoosisisaldus tõepoolest välja arvutada (kus see praegu on?) ja tulemust analüüsida. Sedapuhku saab tulemust võrrelda teooriaga kui palju selline toode tavaliselt glükoosi sisaldab. Teoreetilised alused: Esimene etap: Glükoosisisalduse kvantetatiivseteks määramiseks bioloogilistes objektides rakendatakse sageli enisümaatilist meetodit (kasutatakse ensüümid oksüdaas (GOx) ja peroksüdaas
Teoreetilised alused Bioloogilistes vedelikes kasutatakse glükoosisisalduse määramiseks enamasti ensümaatilist meetodit. See põhineb kahe ensüümi glükoos oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel. GOD on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes (tänu sellele võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust teiste taandavate suhkrute juuresolekul). GOD (,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas) katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD on liitvalk (flavoproteiin) ja sisaldab prosteetilise grupina (mittevalguline komponent) flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensüüm. FADi abil kantakse glükoosi molekulilt kaks H aatomit hapnikule, selle tulemusel glükoos oksüdeerub glükoonhappeks ja tekib FADiga ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. POD (doonor, H2O2-oksüdoreduktaas) osaleb reaktsiooni järgmises etapis. POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem.
Selleks pipeteerisin 0,5 ml sidrunimahla automaatpipetiga 25ml mõõtkolbi ning täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega. 2. Glükoosilahuse valmistamine kalibreerimisgraafiku koostamiseks: Glükoosilahused valmistan glükoosi standardlahuse lahjendamise teel proovide järjestikkusel lahjendamisel saades lahused kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjendused tehakse samm-sammulisel lahjendamisel. Selleks valmistatakse esmalt standardlahusest kindla kontsentratsiooniga (0,25mg/ml), saadud lahjendatakse kaks korda ning teist lahust veel omakorda kaks korda. Pärast lahjenduste tegemist loksutatakse lahused korralikult läbi. 3. Värvusreaktsiooni labiviimine: Statiivi asetatakse 6 puhast ja kuiva katseklaasi ning nummerdatakse need. Proovid valmistatakse järgnevalt: Katseklaa Katseklaasi sisu millega on tegu? optiline tihedus s 1 1 ml dest vesi + 3ml tööreaktiiv kontrollproov 0,0690 D
tolidiin, mille helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Mugavaks substraadiks, mida siin töös kasutataksegi, on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik Töötadakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0; K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini.
TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL KEEMIAINSTITUUT Bioorgaanilise keemia õppetool YKL3312 Biokeemia praktikum Laboratoorne töö 3. Biokatalüüs 3.5. Glükoosi sisalduse määramine ensümaatilisel meetodil. Tallinn 2010 3. BIOKATALÜÜS 3.5 GLÜKOOSI SISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL Glükoosi sisalduse määramiseks kasutatakse meetodit, mis põhineb kahe ensüümi glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel. GODi spetsiifilisus substraadi suhtes annab võimaluse määrata glükoosisisaldust ka teiste taandavate suhkrute juuresolekul. GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. See ensüüm sisaldab endas prosteetilise grupina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koeensüüm. Selle kaasabil kantakse glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit hapnikule. Toimub glükoosi ok
Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Teooria Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. Täna GOx-i substraadispetsiifilisusele -D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx katalüüsib -D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D- glükoonhappe. Järgmises etapis kasutatakse POx-i mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist kasutades elektronide akseptorina teist substraati, H 2O2, mille oksüdeerumisel moodustub H2O. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiin derivaate, mis on det
Tallinn 2010 SISUKORD 1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA ........................... 4 1.1 VALKUDE REAKTSIOONID ............................................................................... 4 1.1.1 Biureedireaktsioon ....................................................................................... 9 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) ........................................... 10 1.1.3 Milloni reaktsioon ....................................................................................... 10 1.1.4 Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon ................................................................... 11 1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega............................................... 11 1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine) .......... 12 1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st ............. 12
1.1 VALKUDE REAKTSIOONID 1. Nimetage, millised toodud valkude reaktsioonidest on üld-, millised erireaktsioonid ja põhjendage sellist jaotust. Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi: -universaalsed e üldreaktsioonid (biureedireaktsioon-on tingitud peptiidsidemete esinemisest), mis on omased kõikidele valkudele, -spetsiifilised e erireaktsioonid (tiooli-, ksantoproteiini-, Milloni reaktsioon jt), mis on iseloomulikud ainult teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele. 2. Kirjutage aminohappe molekuli üldistatud struktuurivalem. Kuidas aminohappeid klassifitseeritakse radikaali keemilise ehituse järgi? Valkude koostises leidub 20 proteogeenseteks aminohapeteks. Mõningad valgud sisaldavad ka nn ebaharilikke aminohappeid, peamiselt üldlevinud aminohapete hüdroksü-, metüül-, fosforüül- jt derivaate.
veega, saades lahuse, mille kontsentratsioon on 0.25 mg/ml.Viimasest lahusest võetakse 5 ml ja lahjendatakse 5 ml dest veega, saades lahuse, mille kontsentratsioon on 0.125 mg/ml. Viimasest lahusest võetakse 5 ml ja lahjendatakse 5 ml dest veega, saades lahuse, mille kontsentratsioon on 0.062 mg/ml. Reaktsiooni läbiviimine. Võetakse 6 katseklaasi. 1.-sse pipeteeritakse 1 ml dest. vett. 2.-sse ja 3.-sse 1 ml uuritavat lahust. 4.-sse, 5.-sse ja 6.-sse 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust. Igasse katseklaasi valatakse 3 ml tööreaktiivi, loksutatakse ja jäetakse 20- ks minutiks reageerima. Reaktsiooni tulemusena katseklaasides 2-6 tekkis helekollane lahus, mis on tingitud punase veresoola sisaldusega lahuses. Viimane etapp on lahuste optilise tiheduse määramine spektrofotomeetril lainepikkusel 410 nm. Kinlda glükoosi kontsentratsiooniga proovide optilise tiheduse tabel ja graafik. 0 0 0,25 0,113 0,125 0,059
(POD) kasutamisel. Tanu GOD-i substraadispetsiifilisele b, D-glukoosi suhtes voimaldab see meetod maarata glukoosisisaldust ka teiste taandavate suhkrute juuresolekul. GOD kujutab endast liitvalku- flavoproteiini, sisaldades proteetilise grupina FAD, mis toimub kui koensuum. Ta oksudeerib glukoos glukoonhappeks ja tekib viimasega ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. +O2 (GOD FAD->FADH2) +H2O COOH-(HCOH)4-CH2OH +H2O2 POD on koostiselt liitvalk kromoproteiin, mis sisaldab prosteetilise ruhma heemi. POD kataluusib spetsiifiliste substraatide oksudeerumist. Reaktsiooni pohimotteline skeem on sellinne: POD Taandatud substraat +H2O2 Oksudeeritud substraat + 2H2O (varviline) Kaesolevas toos kasutatakse POD substraadina kaaliumheksatsuanoferraat(II) POD kataluusib selles Fe2+ oksudatsiooni Fe3+ -ks
annaabi.ee 
