Rakubioloogia arvestuse kordamisküsimuste vastused (2)

Praktiline töö I ­ Rakkude külmutamine/sulatamine 1. Milleks on söötmesse lisatud antibiootikumid? Et bakterid vohama ei hakkaks 2. Milleks on söötmesse lisatud pH indikaator ? Enamus rakuliine vajab kasvamiseks temperatuuri 37°C ja pH-d vahemikus 7,2-7,4. pH indikaatorina kasutatakse fenoolpunast. pH muutumisel happelisemaks muutub indikaator kollaseks ja pH muutumisel aluselisemaks muutub indikaator lillamaks. Rakud taluvad happelist keskkonda paremini kui aluselist. 3. Nimeta sagedasemaid rakukultuuri saastajaid. Pärm, bakterid, mükoplasma, viirused, teised rakuliinid 4. Mis on rakuliin ja rakkude primaarkultuur , mille poolest need erinevad? primaarsed kultuurid ­ koest eraldatud, paljunevad piiratud arv kordi (meie majas kasutatakse näiteks roti neuroneid ) rakuliinid ­ surematud st. paljunevad piiramatu arv kordi, kuid peab siiski arvestama asjaoluga, et aja jooksul rakud siiski muutuvad. Pärinevad reeglina embrüonaalsetest või kasvajalistest kudedest. Tavaliselt ostetakse rakupangast (ATCC, DSMZ) ja paljundatakse ise edasi. Tuntumad rakuliinid HeLa ­ inimese emakakaela kartsinoomist; HEK293 ­ inimese embrüonaalsed neerurakud; Cos7 ­ rohepärdiku neerurakud; NIH3T3 ­ hiire embrüonaalsed fibroblastid ; ... Primaarne rakukultuur on otseselt koest eraldatud rakkudest koosnev ja piiratud jagunemisvõimega kloon . Rakuliin on imortaliseeritud kloon, mis on võimeline paljunema/ jagunema piiramatult. Immortaliseeritud liine saab kas iseeneslike mutatsiooni tagajärjeliste transformatsioonide kaudu, ka eraldades rakke kasvajatest. Tekitada kunstlikult telomeraasi sisseviimisel rakku. Rakuliin sageli aneupolidne- kromosoomide arv normaalsest erinev (tavaliselt suurem). Eri rakutüübid transformeeruvad eri sagedusega, suured liikidevahelised erinevused. 5. Miks rakud vajavad kasvamiseks seerumit? Et rakud end hästi tunneksid. Seerum -keskkond + mitogeenid=kasvufaktorid ja muud proliferisatsiooniks vajalikud substansid. Enamasti kasutatakse veise loote seerumit (FBS (ka FCS) ­ foetal bovine serum) kontsentratsiooniga 10%. Seerum on hüübinud vere vedel osa. Seerumi koostis pole defineeritud, ta sisaldab albumiine, kasvufaktoreid ja teisi valke, vitamiine, rasvhappeid , lipiide jm; seerum suurendab ka söötme puhverdamisvõimet. 6. Miks peab rakkude külmutamisel lisama DMSO-d? Dimetüülsulfoksiid. Kaitseb rakke külmutamise ajal. Soojas on rakkudele kahjulik. 7. Mis on Bürkeri kamber? Rakkude loendamise kaadervärk 8. Kuidas teha vahet elus ja surnud rakkudel kinnituvate rakkude korral? Surnud rakud hulbivad söötmes. 9. Kuidas rakke paljundatakse? Sööde, pH 7,2-7,4, CO2 5%, inkubaator 37
Praktiline töö II ­ Transfektsioon 1. Mida nimetatakse transfektsiooniks, milliseid alternatiivseid meetodeid saab kasutada? Transfektsioon = transformatsioon +infektsioon Transfektsioon on võõr-DNA viimine loomarakku plasmiidi kujul (bakterite puhul nimetatakse sarnast protsessi transformatsiooniks). Viiruste abil DNA üle kandmist nimetatakse transduktsiooniks. Keemilised meetodid tekitatakse DNA- reagent kompleks: · Kaltsiumfosfaat ­ tekitatakse kaltsiumfosfaat-DNA sade, mis lisatakse rakkudele, avastati 1973, hea odav, probleemiks efektiivsus. · katioonsed polümeerid (PEI-polüetüleenimiin, DEAE dekstraan) - soodustavad DNA seostumist membraaniga ja endotsütoosi, puuduseks toksilisus. · dendrimeerid ­ suured hargnevad polümeerid, mis seovad DNA-d. · liposoomid ja katioonsed lipiidid (näit. Lipofectamine) ­ fuseeruvad membraaniga, suhteliselt efektiivne, vähe toksiline , probleemiks hind. Füüsikalised meetodid. · elektroporatsioon ­ rakule tehakse elektrisokk, mille tulemusel tekivad membraani väikesed avad ja DNA siseneb rakku. Tapab osa rakke maha. · sono-poratsioon ­ ultraheliga · optiline transfektsioon ­ laseriga tehakse raku membraani auk, kasulik üksikute rakkude uurimiseks. · pommitamine kullaosakestega (geenipüss) · magnetofektsioon ­ DNA seotakse magnetiseeruvate nanoosakestega ja magnetvälja mõjul sisestatakse rakku. · Mikroinjektsioon ­ DNA süstitakse otse üksikutesse rakkudesse, transgeensete loomade tegemisel kasutatakse 2. Mis on GFP, milliseid konkreetseid ekspresioonikonstrukte praktikumis kasutati? GFP- green fluoroescent protein , GFP võib funktsioneerida kui proteiin tag, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning tänu temale seotud signaaljärjestusele, saab sisseviidud DNA-valk kompleks seostuda just spetsiifilisse kohta rakus, ning tänu fluoroessents- efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis nähtav.Ekspressioonikonstruktid olid plasmiidid GFP järjestuse ja erinevate signaalidega, mille tõttu ekspresseerus GFP erinevates rakupiirkondades. PEI ­ polüetüleenimiin ­ pakib DNA kokku ja interakteerub membraaniga ja difundeerub läbi membraani. 3. Millised elemendid peavad olema eukarüootses ekspressioonivektoris? Loomarakkudele mõeldud ekspressioonivektor (plasmiid) sisaldab: 1.komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (prokarüootset replikatsiooni alguspunkti, antibiootikumi resistentsusgeeni); 2.kloneerimisala (MCS) erinevate restriktaaside lõikekohad; 3.uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul); 4.reportergeeni (GFP, lutsiferaas, lacZ jt.) või märgise (tag; FLAG, myc, V5, GFP) järjestust. 5.eukarüootset promootorit (CMV, SV40 ) ja polüadenüleerimisjärjestust (SV40); 6.selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti.
Praktiline töö III ­ Immuunotsütokeemia 1. Mille poolest on erinevad monoklonaalsed ja polüklonaalsed antikehad? Mka reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis, on väga spetsiifilised 2. Mis on epitoop ? Too välja kaks erinevat tüüpi epitoopide rühma ja kirjelda mille poolest need erinevad. Antigeeni osa, mis seostub spetsiifiliselt antikeha retseptorile. Konformatsioonilised(tertsiaarstruktuuri järgi) ja lineaarsed (aminohappejäägi järjestuse järgi) 3. Kuidas töötab fluorestsentsmikroskoop? Ergastav valgus juhitakse läbi filtri uuritava objektini. Filter laseb läbi ainult kindla lainepikkusega valgust, mis on sobiv fluorokroomi ergastamiseks. Emiteeritud valgus sorteeritakse palju tugevamast ergastavast valgusest teise filtri abil. 4. Nimeta erinevaid võimalusi rakukomponentide märgistamiseks fluorokroomidega? Fluorestseeruvad värvid: Difundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. Näiteks DNA värvid propiidiumjodiid, Hoest, DAPI jt. Immuunofluorestsents: Kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy, jne.) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. Fluorestseeruvad valgud : Selleks ekspresseeritakse rakkudes uuritava valgu ja fluorestseeruva valgu liitvalku. Samas kannatab ka PFA-ga fikseerimist ja saab vaadata ka fikseeritud rakkudes. 5. Mis on Stokes 'i nihe ? Vahetult peale aine ergastamist toimub enamasti kiire termiline relaksatsioon mõnesugusesse energeetiliselt madalamasse seisundisse, millelt seejärel lähtub luminestsentskiirgus. Seega fotoluminestsentsi lainepikkus on suurem ergastava kiirguse lainepikkusest (Stokes'i nihe) ning selle karakteristikud ( spekter , kestus, polarisatsioon ) on põhiliselt määratud juba aine enda omadustega ja sõltuvad nõrgalt ergastava kiirguse parameetritest. 6. Millised ensüümid viivad läbi histoonide atsetüleerimist ja deatsetüleerimist ning kuidas mõjutab see transkriptsiooni? HAT ja HDAC kui on atsetüleeritud, pole laengut, histooniga ei seostu, transkriptsioon toimub 7. Nimeta erinevaid tsütoskeletti moodustavaid filamente ? Millistest valkudest need koosnevad? Mikrofilamendid - aktiin , mikrotuubulid ­ tubuliin, EB3, intermediaarsed filamendid - olenevalt rakutüübist
Praktiline töö IV - Apoptoos ja nekroos 1. Defineeri apoptoos ja nekroos. Apoptoos- raku programmeeritud surm, mis on käivitatud raku enda poolt. Nekroos- raku mitte programmeeritud surm, rakk lendab tükkideks, tekitab põletikke. Apoptootilises rakus toimuvad kindlad biokeemilised ja morfoloogilised muutused, mis lõpevad raku lagunemisega väikesteks membraaniga ümbritsetud vesiikuliteks, mis fagotsüteeritakse kiiresti makrofaagide poolt. Seega apoptootiline rakk lüüsub s.t. tema tsütoplasma komponendid ei satu ekstratsellularsesse ruumi. Nekroosi puhul aga kaotab raku membraan oma terviklikkuse, rakk laguneb ning raku komponendid satuvad ekstratsellulaarsesse ruumi. 2. Kirjelda protsesse, mis eristavad apoptoosi nekroosist. Apoptoos on kiirem kui nekroos, apoptoosi puhul rakk lüüsub, st tema tsütoplasma komponendid ei satu ekstratsellulaarsesse ruumi, vastupidiselt nekroosile. Apoptoos on geneetiliselt kodeeritud ja apoptoosilises rakus toimuvad kindlad biokeemilised ja morfoloofilised muutused, mis lõpevad raku lagunemisega väikesteks membraaniga ümbritsetud vesiikuliteks, mis fagotsüteeritakse. 3. Kirjelda apoptootilisi sündmusi, millised on varajased ja millised hilised sündmused 1. Morfoloogilisi muutusi pole näha, suureneb transglutaminaasi transkriptsioon ning aktiveeritakse kaspaasid; 2. Kromatiin kondenseerub, aktiveeritakse nukleaasid, mis lagundavad kromatiini nukleosoomi suurusteks fragmentideks, tuum fragmenteerub; 3. Tsütoplasma kondenseerub, kuna desmosoomsed kontaktid ja intermediaarsed filamendid lagundatakse; raku membraanis toimuvad muutused, mis markeerivad apoptootilise raku fagotsütoosiks (fosfatidüülseriin eksponeerub raku välismembraanile) rakk laguneb membraaniga ümbritsetud vesiikuliteks. 4. Kas apoptoos on pöörduv ja kui jah, siis millistes faasides on see võimalik? Pöörduv ainult esimeses faasis 5. Miks fragmenteerub DNA 100 aluspaaristeks lõikudeks? Raku tuum fragmenteerub ja kromatiin kondenseerub, millega kaasneb endonukleaasne aktiveerimine , mis lõikab läbi kromatiini (DNA) nukleosoomide vahelise nn. linker DNA, selle tulemusel tekivad iseloomulikud DNA fragmendid 6. Mis on anneksiin ja miks saab seda kasutada apoptoosi määramiseks? Missuguseid markereid (molekulaarseid protsesse) veel kasutatakse apoptoosi määramiseks? Anneksiin on valk, mis seondub fosftidüülseriiniga ning muudab apoptoosis oleva raku nähtavaks. DNA- fragmentatsioon, immuunotsütokineetliliselt. 7. Mis juhtub rakkudega, mis on läbinud apoptoosi? Apoptootilises rakus toimuvad kindlad biokeemilised ja morfoloogilised muutused, mis lõpevad raku lagunemisega väikesteks membraaniga ümbritsetud vesiikuliteks, mis fagotsüteeritakse kiiresti makrofaagide poolt 8. Kas apoptoosi on võimalik esile kutsuda ka retseptorvahendatult? Nimeta üks apoptoosi indutseeriv faktor. On küll võimalik. Tsütotoksilised T-lümfotsüüdid indutseerivad apoptoosi viirusest infitseeritud rakkudes ja kasvaja rakkudes. 9. Missugune roll apoptoosiprotsessis on mitokondritel? Tsütokroom C ­ hingamisahela ensüüm (mitokondri sisemembraan). Apoptoos -> läbi mitokondri. Kuna mitokondrid annavad rakule energiat, siis seda rünnatakse esimesena. 10. Kuidas määrata apoptoosi poolt aktiveeritud kaspaase? Kirjelda protsessi. Immunotsütokeemiliselt on võimalik detekteerida aktiveeritud kaspaase vastavate antikehadega. Selliseid interaktsioone saab hiljem määrata mikroskoopiliselt või kasutades FACS-i Kaspaadid lõikavad valku peale aminohapet aspartaati (asp). Kaspaase on terve perekond ja nende iseloomulikuks omaduseks on see, et nad on ülispetsiifilised aspartaadi suhtes, selle aminohappe olemasolu on absoluutselt vajalik kaspaasile äratundmiseks. Kaspaasid aktiveeruvad kaskaadselt, kõigepealt aktiveerub kaspaas 8, see omakorda aktiveerib teisi. Kaspaaside toimel aktiveeruvad ka nukleaasid, mis asuvad lõikama DNA-d. Nukleaas on rakus seotud inhibitoorse valguga, mille kaspaas lagundab ning seejärel toimubki nukleaasi aktiveerumine. Kaspaaside kaskaadi käivitumisel toimub rakustruktuuride süstemaatiline purustamine, sündmused toimuvad kindlas järjekorras ja ette-ennustatavalt. Rakk purustatakse kiiresti, 30-60 minuti jooksul. 11. Milliste avastuste eest said Nobeli preemia 2002.a. Sydney Brenner ja H. Robert Horvitz? Avastuste eest, mis puudutavad organite arengu ja programmeeritud surma geneetilist regulatsiooni.