Praktiline töö nr. 2: SDS-PAGE elektroforees NB! Geeli valmistamisel kasutasime akrüülamiidi, mis on tervisele kahjulik, seetõttu töötasime kummikinnastega. Elektroforeesi aparaadi kokku panemine Geelikihtide valmistamine: 1. Valmistada lahutav geel (resolving gel) (10%), mis koosneb järgmistest komponentidest: Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8% 3,3 ml 4x lahutava geeli puhver (1,5M Tris-Cl, pH 8,8) 2,5 ml 10% SDS 0,1 ml mQ 4,0 ml APS 70 µl
TTÜ Füüsikalise keemia õppetool KOLLOIDOSAKESTE ELEKTROKINEETILISE Töö nr: 6/9 POTENTSIAALI ELEKTROFOREETILINE MÄÄRAMINE Liis Hendrikson KATB 41 Teostatud: Kontrollitud: Arvestatud: 28.03.2012 Joonis . Elektroforeesi uurimise seadme põhimõtteskeem 6. SOOLI VALMISTAMINE Töö ülesanne Valmistada raudhüdroksiidi kolloidlahus. Määrata kolloidosakeste laengumärk ja potentsiaal elektroforeesi teel. Töö käik Raudhüdroksiidi sooli võib saada, kui intensiivsel segamisel juhtida 10 ml 2% värskeltvalmistatud lahust 250 ml keevasse vette. Toimub hüdrolüüsireaktsioon:
füüsikalise keemia õppetool Töö nr: 6/9k Töö pealkiri: Fe(OH)3 sooli valmistamine/ Kolloidosakeste elektrokineetilise potentsiaali elektroforeetiline määramine Üliõpilase nimi ja eesnimi: Õpperühm: Töö teostamise Kontrollitud: Arvestatud: kuupäev: 13.02.2012 SKEEM Elektroforeesi uurimise seadme põhimõtteskeem Töö eesmärk: Uurida elektroforeesi nähtust, mtes piirpinna kolloidlahus- dispersioonikeskkond liikumise joonkiirust. Selle phjal määrata osakeste laengu märk ja arvutada elektrokineetiline potentsiaal ( - potentsiaal). Töö käik: Kõigepealt valmistada raudhüdroksiid sool, mida saab teha intensiivsel segamisel juhtides 10ml 2% värskelt valmistatud FeCl3 lahust 250ml keevasse vette. Seejärel võtakse
füüsikalise keemia õppetool Töö nr: 6/9k Töö pealkiri: Fe(OH)3 sooli valmistamine/ Kolloidosakeste elektrokineetilise potentsiaali elektroforeetiline määramine Üliõpilase nimi ja eesnimi: Jekaterina Miloserdova Õpperühm: KATB47 Töö teostamise kuupäev: Kontrollitud: Arvestatud: 17.03.2014 Töö eesmärk: Uurida elektroforeesi nähtust, mtes piirpinna kolloidlahus- dispersioonikeskkond liikumise joonkiirust. Selle phjal määrata osakeste laengu märk ja arvutada elektrokineetiline potentsiaal ( - potentsiaal). Töö käik: Kõigepealt valmistada raudhüdroksiid sool, mida saab teha intensiivsel segamisel juhtides 10ml 2% värskelt valmistatud FeCl3 lahust 250ml keevasse vette. Seejärel võtakse kasutusse elektroforeesi uurimise seade, mille külgtoru täidetakse Fe(OH)3 kolloidlahusega, U-
polümeriseeruvad väga kiiresti. Paneme kokku vajaliku aparatuuri ja lisame kahe klaasi vahele alumist geeli. Siis lisame natuke vett selleks, et geel tarduks kõikides kohtades ühtlaselt. Kui alumine geel on tardunud valame vee välja, lisame ülemise geeli tuubi TEMED-i ja valame kahe klaasi vahele. Paneme hambad peale ja ootame, kuni geel tardub. Kui geel on tardunud võtame hambad ja klaasid ära ning paneme geelid elektroforeesi vanni. Lisame vanni Running puhvrit. Kanname 10 µl proovi geelile, järjekorras: 1proov; 2proov;Markes; 1proov; 2proov; 100 marker; 250 marker; 500 marker; Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min. (läks natuke kauem) Geel 1 2 M 1 2 100 250 500 Ülemine osa(4%) Alumine osa(10%)
Kolloidosakeste elektrokineetilise potentsiaali elektroforeetiline määramine Üliõpilase nimi ja Õpperühm eesnimi Töö teostamise Kontrollitud: Arvestatud: kuupäev: 09.03.2011 Joonis Elektrofereesi uurimise seadme põhimõtteskeem Fe(OH)3 SOOLI VALMISTAMINE TÖÖ EESMÄRK Valmistada raudhüdroksiidi kolloidlahus. Määrata kolloidosakeste laengumärk ja - potentsiaal elektroforeesi teel. TÖÖVAHENDID FeCl3 2% värskelt valmistatud lahus, keeduklaasid, pipetid. TÖÖ KÄIK Raudhüdroksiidi sooli vib saada, kui intensiivsel segamisel juhtida 10 ml 2% värskeltvalmistatud FeCl3 lahust 250 milliliitrisse keevasse vette. Toimub hüdrolüüsireaktsioon FeCl3 + 3H2O = Fe(OH)3 + 3HCl Raudhüdroksiidi raskestilahustuvad molekulid moodustavad omavahel ühinedes osakese tuuma
TTÜ Materjaliteaduse Instituut Füüsikalise keemia õppetool Töö nr 6/9k Kolloidosakeste elektrokineetilise potentsiaali elektroforeetiline määramine Joonis 1. Elektroforeesi uurimise seadme põhimõtteskeem Fe(OH)3 SOOLI VALMISTAMINE Töö eesmärk Töös on vaja valmistada raudhüdroksiidi kolloidlahus. Määrata kolloidosakeste laengumärk ja ζ - potentsiaal elektroforeesi teel. Töövahendid FeCl3 2% värskelt valmistatud lahus, keeduklaasid, pipetid. Töö käik Raudhüdroksiidi sooli saab, kui intensiivsel segamisel juhtida 10 ml 2% värskelt valmistatud FeCl3 lahust 250 milliliitrisse keevasse vette. Toimub hüdrolüüsireaktsioon FeCl3 + 3H2O = Fe(OH)3 + 3HCl Raudhüdroksiidi raskestilahustuvad molekulid moodustavad omavahel ühinedes osakese tuuma
· Kui geel on tardunud, võtame kammi ära ning saame kammi hammastesse oma proovid lisada. Lisame vanni Running puhvrit. · Kanname 10 µl proovi geelile, järjekorras: 1) Proov 1-kontrollproov 2) Proov 2-üleekspresseerunud valguga 3) Marker suuruse määramiseks 4) Proov 1 5) Proov 2 6) PSA kontsentratsiooni määramiseks 100 µg/µl 7) 250 µg/µl 8) 500 µg/µl · Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min. Geel 1 2 M 1 2 100 250 500 · Pärast elektroforeesi toimumist võtame geeli välja ja lõikame ülemise osa ära. Alumise osa lõikame markeri keskelt pooleks- väiksem osa läheb immunoblotti ja suurem osa värvimiseks. Geeli värvimine · Suurema osa geeli värvime seguga:
Kui alumine geel on tardunud valame vesi välja ,lisame ülemise geeli tuubisse TEMED-i ja valame kahe klaasi vahele. Paneme ,,kamm" peale ja ootame ,kuni geel tardub. · Kui geel on tardunud võtame ,,kamm" ära, seejärel võtame klaasid ära ja paneme geelid freesi vanni. Lisame vanni ,,Running ,,puhvrit. · Kanname 10 µl proovi geelile, järjekorras: 1; 2;M; 1; 2; 0,5; 1; 1,5; · Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min. Geel 1 2 M 1 2 0,5 1 1,5 · Pärast elektroforeesi toimumist võtame geel välja ja lõikame pooleks. Väiksem osa läheb immunoblotti ja suurema osa värvime. Geeli värvimine. · Suurema osa geeli värvime seguga: 25% isopropanool, 7% äädikhape, 0,1% Commasie Blue R.
Fifth level Defektse alleeli tuvastamine märgistatud DNA-proovi abil Uuritava kromosoomi DNA denatureeritakse ja lisatakse teadaolevale mutatsioonipiirkonna järjestusele komplementaarsed DNA proovid. DNA-proovi seostumine kromosoomis on tuvastatav neil oleva märgise järgi DNA-sõrmejälgede metoodika Iga inimese sõrmejäljed on kordumatud DNA-fragmentide pikkuserinevused annavad DNA elektroforeesi käigus mustri,mis on individuaalselt sama kordmatu kui tõelised sõrmejäljed. DNA-restriktsioonanalüüs:DNA-sõrmejäljed Bioloogilisest proovist(veri,koetükk,sperma vms)eraldatakse rakutuumad DNA eraldatakse tuumadest ning restriktaaside abil lõigatakse DNA eri pikkusega lõikudeks Ühesuguse pikkusega DNA-lõigud paigutuvad eletroforeesi käigus ühte piirkonda.Eri inidviidide fragmendipikkuste muster-"sõrmejäljed"-on erinevad Polümeeraasne ahelreaktsioon
MATERJALITEADUSE INSTITUUT FÜÜSIKALISE KEEMIA ÕPPETOOL Üliõpilane: Teostatud: Õpperühm: Kontrollitud: Töö nr: 6/9K Kaitstud: Fe(OH)3 SOOLI VALMISTAMINE KOLLOIDOSAKESTE ELKTROKINEETILISE POTENTSIAALI ELEKTROFOREETILINE MÄÄRAMINE SKEEM Tööülesanne: Uurida elektroforeesi nähtust, mtes piirpinna kolloidlahusdispersioonikeskkond liikumise joonkiirust. Selle phjal määrata osakeste laengu märk ja arvutada elektrokineetiline potentsiaal ( - potentsiaal). Töö käik: külgtoru täidetakse juhendaja poolt määratud kolloidlahusega, U-torusse kallatakse umbes 15 ml külgvedelikku ja asetatakse kohale CuSO4-ga täidetud vahelahused. Seejärel asetatakse kohale soolasillad ja Cu-elektroodid, mis ühendatakse alalisvoolu toiteallikaga
ja kuumutades, kindlaid DNA piirkondi Iga tsükliga kahekordistub algne DNA matriitsjärjestus Enam kui kahe DNA piirkonna samaaegset kopeerimist tuntakse multipleks-PCR-i nime all. DNA analüüs isikutuvastamiseks kasutatakse enamasti lühikesi kordusjärjestusi ehk STR lookusi, mille alleelid erinevad üksteisest pikkuse osas, seega ei ole vaja määrata DNA nukleotiidide järjestust, vaid kopeeritud DNA lõikude pikkusi Selleks kasutatakse elektroforeesi DNA analüüs Kuna aga multipleks-PCR-i kaudu paljundatud DNA fragmendid on siiski küllalt lähedase pikkusega, kasutatakse nende täiendavaks eristamiseks fluorestseeruvaid värve, mis on ühendatud reaktsiooni läbiviimiseks kasutatavate praimeritega Kõik algselt matriitsilt kopeeritud DNA-lõigud muutuvad värviliseks ning visualiseeritakse värviliste piikidena elektroferogrammidel DNA analüüs Viimane etapp seisneb tulemuste
detekteerida kõiki aineid mis kiirgavad fluorestsensi. - Juhtivusdetektor - hea selektiivsus - hea tundlikkus - mõõdetakse ioniseeritud analüüte. - Elektronkeemiline detektor - hea selektiivsus - suurepärane tundlikkus - mõõdetakse elektrivoolu mis tekib redoksreaktsioonide tulemusena. - Massispektromeetriline detektor - suurepärane selektiivsus - suurepärane tundlikkus - proov ioniseeritakse ja mõõdetakse massi/laengu suhet. 35. Elektroforeesi definitsioon Elektroforees - laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul. 36. Elektroosmootse voolu teke Pingestatud kapillaartorus ei hakka liikuma ainult analüüsitavad ioonid vaid ka taustelektrolüüt/puhver. Pingestamisel hakkavad lahuses olevad prootonid liikuma katioodi poole => prootonid on solvateerunud ehk ümbritsetud vee molekulide kihiga ja tõmbavad oma liikumisel kaasa kogu puhvri, seega voolab puhver nii öelda anoodilt katoodile. 37
fragmenti, dNTP olemasolul võib sünteesida kaksikahelat. Seda sünteetilist järjestus amplifitseeritakse PCR abil, lisades praimeri (forward ja reverse), Mg (katalüsaator), dNTP-d, Taq polümeraasi (teostab sünteesi kõrgel temperatuuril). PCR käigus toimub ahelate denatureerimine, praimeritega seondumine ja süntees. Seda tsüklit korratakse 30 korda. Seda etappi kontrollitakse kasutades elektroforeesi. Järgmisena toimub selle järjestuse ja vajaliku vektori töötlemine. Sõltuvalt sellest, mis otsad tahetakse saada (,,blunt" või ,,sticky") kasutatakse vastavalt vajalikud restriktaase. Lõigatakse sama restriktaasidega nii vektorit kui ka järjestust. Puhastatakse saadu produktid. Siis ligeeritakse vektorisse saadud järjestust (takistades ise-ligeerimist, kasutades nt. defosforüülimist). Siis teostatakse vektori transformeerimine bakterirakku, kus huvipakkuva
- eemalda supernatant - pesemiseks lisa sademele ~200 l 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min 7 Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt eraldatud/puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis). (10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust: 10 l DNA-d + 2,5 l 5 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla) Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse ,,hambasse" ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. Elektroforeesi tulemused: Lisaülesanded: 3.1) Võrdle antud protokolli DNA kokaraamatus tooduga (vt. lisa). Millised etapid on samad, millised erinevad? Sinu arvamused, ettepanekud, küsimused? Kokaraamatus lisatakse lahust III 150µl ,me lisasime lahust III 400µl. Kokaraamatus lisatakse lahust I 100 µl, me lisasime lahust I 200µl. 3.2) Kui palju tuleb võtta RNaasA-d, mille algkontsentratsioon on 10 mg/ml, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5 ng/l 1 ml-s TE-s
Taolise probleemi ärahoidmiseks kasutatakse proovi ettevalmistamise käigus redutseerivat agenti dithiothreitol (DTT või Clealand`i reagent) või 2-merkaptoetanooli (2-ME). Redutseerivates tingimustes lagunevad disulfiidsidemed ning disulfiidseotud valkude oligomeerid algunevad. „Plaat” geeli vorm koosneb kahest paralleelsest klaasplaadist või plastiklehest, mille vahele on asetatud tihendid (spacerid) vahemiku tekitamiseks ning geeli äravoolu takistamiseks servadest. SDS-PAGE elektroforeesi puhul kasutatakse kihilist kahe geeli kombinatsiooni. Esmalt valatakse kahe plaadi vahele lahutav geel ning järgnevalt kontsentreeriv geel. Kontsentreerivasse geeli asetatakse enne polümeriseerumist kammid, mille abil tehakse geeli taskud proovide jaoks. Lahutav ja kontsentreeruv geel erinevad puhvri konsentratsiooni ja pH poolest. Pinge sisselülitamisel liiguvad anioonid anoodile (alumine elektrood) ning katioonid katoodile (ülemine elektrood)
regulaatorelementi sisaldavat DNA fragmenti, mis on eelnevalt radioaktiivselt märgitud. Lane 1 is a negative control, and contains only DNA. Lane 2 contains protein as well as a DNA fragment that, based on its sequence, does not interact. Rida 3 sisaldab valku ja DNA fragmenti, mis reageerib. Saadud kompleks on suure, raskem ja aeglasem. Muster real 3 on sellisel juhul kui kogu DNA oleks seotud ja elektroforeesi ajal ei toimunud üldse kompleksi dissotsieerumist. Kui need tingimused ei ole täidetud, siis võib seal olla ka teine band, (real 3), mis tähendaks vaba DNA olemasolu või DNA-valk kompleksi dissotsieerumist. Valgule võib lisada ka veel antikeha, mistõttu moodustub veel suurem kompleks ja ta liigub veel vähem.
kordusjärjestused. SNP - ühenukleotiidne erisus/varieeruvus. (vt: http://www.haridustehnoloogid.ee/veebiseminarid/30-veebiseminar-ulevaade- dna-st-ja-isiku-tuvastamisest/). Isiku tuvastamiseks tuleb võtta proov (sülg, veri jne), seejärel eraldatakse DNA. Hinnatakse kvaliteeti ja kogust ning paljundatakse PCR meetodil. DNA sõrmejälje metoodika- DNA-fragmentide pikkuste erinevused annavad elektroforeesi käigus mustri, mis on kordumatu kui sõrmejälg.
Nii jõuavad ained stardijoonest erinevatele kaugustele. Eristamiseks kasutakse ultraviolettlambi või kemikaali lahused. 12. Elektroforees Laetud osakesed liikumine elektriväljas alusel. Liikumine sõltub elektrilisest potentsiaalist ja summaarlaengust. Valkudel on erinev summaarlaeng, lahustavad naj elektriväljas. Levinum on geel-elektroforees. Lahustatavad komponendid jaotuvad liikuvuse alusel kandjal kitsaste vööndidena,mis on vaja indifitseerida. Geel-kandjate poorne struktuur tagab elektroforeesi suurema kiiruse ja lahutusvõime. Reguleerib valgumolekulide liikumist sõltuvalt mõõtmetest ja Mr-st. Kõike efektiivne on PAGE, kus PAAG toimib poorse molekulaarsõelana. Seal baseerub kõrglahustusvõime geeli poorsusel ka pH gradiendil. Elektriväljas lahutunud uuritava segu bändi(väiksed liiguvad kiiresti,suured ei) imutatakse värvimisega. Värvained seonduvad üskne lahutunud komponentidega. PAGE kasutakse kui väga detailse proteinogrammi saamiseks 13
modulaatori (mehhaanilised klapid, sorptsioon/desorptsioon via temperatuur). Saadakse pikk ühemõõtmeline kromatogramm, organiseeritakse 2D pildiks. Kasutatakse keeruliste seguse analüüsiks. Esimese kolonni aeglahutus võrdub teise kolonni lahutusajaga. Rõhu ühikud Briti ja meetrilistes süsteemides 1 atm 760 mm Hg 1 at - 1 kg/cm^2 Pa=N/m^2 1 bar=0,987 atm=1,02 at=10^5 Pa=14,5 psi 1 pound=0,453 kg 1000 psi = 70 bar, 100 bar=1450 psi atm=psi/14,5 Elektroforeesi nähtus ja kapillaarelektroforees Laetud osakeste liikumine elektrivälja mõjul. Lahutumine põhineb erinevast massist ja laengust tingitud erinva kiirusega liikumisel, samuti ka rakendatavast pingest. Gaasides - ioonmobiilsus Ioone sisaldavale lahusele pinget rakendades hakkavad ioonid liikuma, katioonid (+) katoodile (-), anioonid (-) anoodile (+). Kapillaarelektroforeesil toimub ainete elektroforeetiline lahutamine kapillaarkolonnis. Elektroosmoosse voo tekkimine elektroforeesis
7 Vedeliku 6,5 viskoossus 6 mPas ln 5,5 741.7347616 5 331.5770293 4,5 172.5752824 4 88.78246991 0,00315 0,0032 0,00325 0,0033 0,00335 0,0034 1/T 14 316 033 0,00335 0,0034 Potentsiaalide vahe Elektroodide vaheline Piirpinna Elektroforeesi elektroodidel U kaugus L edasinihkumine aeg t h V m m s 150 0,233 0,005 1500 Külgvedeliku Külgvedeliku viskoossus dielektriline läbitavus Pa*s 0,8902 78,53 Jrk Lahuse normaalne Mõõdetud Elektrijuhtivus Ekvivalentjuhtivus nr
ATP roll: · ATP on kontraktsiooni vahetu energiaallikas: tema hüdrolüütilise lõhustumise energiamuut kasutub müosiinipeakeste liikumiseks (keemiline energia konverteerub mehhaaniliseks) · ATP hüdrolüütilise lõhustumise energiamuudu arvel eemaldab Ca-pump sarkoplasmast kaltsiumiioone (vastu kontsentratsioonigradienti) 6. Vereplasma valgud Vereplasma proteinogramm elektroforeesi abil eraldatud valgud. Jaotus: · albumiinid · globuliinid ( 1, 2, , ) Vereseerumis: Prealbumiin Albumiin 1-globuliinid (nt. 1-antiproteaas, 1-happeline glükoproteiin, -lipoproteiin) 2-globuliinid (nt. 2-makroglobuliin, haptoglobuliin, tseruloplasmiin, CRP) -globuliinid (nt. transferriin, C3-komplementfaktor, -lipoproteiin) -globuliinid (nt. IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) ( vereplasmas oleks ka fibrinogeen) Veres on albumiine rohkem. Väga kiiresti metaboliseeruvad valgud
11. Kes on GMO-d, kuidas ja miks neid luuakse? GMO- geneetiliselt muundatud organism, kunstlikult geenide manipulatsiooni teel loodud. Miks luuakse: odav, lihtsasti loodav, saagikus suur, kahjuritõrjetele mittetundlikud jne. 12. Milles seisneb geneetilise sõrmejälje idee ning isaduse ja isiku tuvastamine . Kuidas see metoodika töötab? Geneetilise sõrmejälje idee seisneb DNA-fragmentide pikkuses, mis annavad DNA elektroforeesi käigus mustri, mis on individuaalselt kordumatu. Tänu sellele saab tuvastada isa, paljastatakse kurjategijat, määratakse isikuid kindlaks jne.Sellega saab testida ka organidoonori koe sobivust patsiendile. 13. Millised on need anatoomilised (füsioloogilised) eripärad, mis eristavad inimest teistest loomadest (võrdlus teiste primaatidega)? Eripärad: Väga suur ajumaht Püstine kehahoiak
Geelfiltratsioon Ioonvahetuskromatograafia Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis. Isoelektriline fokuseerimine – elektroforeesi geeli on moodustatud pH gradient; sellel geelil liiguvad valgud seni, kuni on jõudnud sellise pH-ga geeli ossa, mis vastab nende isoelektrilisele puntkile (pI) e. kui valgu summaarne laeng muutub nulliks ja kui laeng on null ei ole võimalik enam elektriväljas edasi liikuda. α – heeliks – valgu helikaalne sekundaarstruktuur, mida stabiliseerivad keskteljega paralleelset asetsevad vesiniksidemed aminohapete amino ja karboksüülrühmade vahel.
mittelooduslikud tingimused, kus polümeraas pole võimeline DNA'ga seonduma. Nüüd jookseb kolonnist läbi (puhas) DNA polümeraas/. Sellist geeliga kolonnkromatograafiat nimetatakse Liquid Chromatography'ks. Avaldades kolonnile survet (rõhku), siis nim seda HPC'ks (High Pressure liquid Chromatograpy'ks). HPC puhul saab sisuliselt väga keerulisest segust erisatda suvalisi molekule. Elektroforees on sisuliselt kromatograafia edasiarendus. Tänapäeval kasutame üldjuhul sellised plaat-elektroforeesi masinaid, et saaks korraga palju prove üksteise kõrvale kanda, siis põhimõtteliselt võime ka kolonni rakendada elektrivälja. /vaadata meetodi kohta sekveneerimise juures/. Kõik nukleiinhapped on alati negatiivse laenguga, seega liiguvad alati +elektroodi poole. Valgu molekulidel võivad olla erinevad laengud, sest erinevatel aminohapetel on erinevad laengud, mis annavadki erineva iseloomu, on olemas selliseid
See sisaldab soojusliikumises osakesi ja see liigub kolloidosakesega kaasa. Kolloidkeemia Kristian Leite 2012 Materjal/aine Kalju Lott 25. Elektrokineetilised nähtused. Esimese rühma el. kin nähtused Elektroforees Elektroforees on protsess, kus (kolloid)osakesed liiguvad välise elektrivälja mõjul. Graanulale avaldub jõud. Elektroforeesi liikmeid on mitmeid. Ühel variandil jaotatakse laengu järgi. Teistel juhtudel võib jaotada aga molekulmassi järgi (poorne geel, ühtne laeng SDS) Elektroforeesi kaudu tseeta-potentsiaali mõõtmine Laeng avaldub järgmiselt Aga Selle modifitseerimisel (asenduse tegemisel) saame ka valemi potentsiaali leidmiseks. Seega saab elektroforeesil potentsiaal määrata Elektroosmoos Elektroosomoos on protsess, kus dispersioonikeskkond liigub, dispergeeritud faas ei liigu
coli positiivse vastuse? Laktoos, β-D-glükuroniidid, briljantroheline, sapisoolad. 15. Kuidas käituda siis, kui E. coli tuvastamisel indooltest annab positiivse vastuse, kuid GUR aktiivsus puudub? gusA geen on defektne. 16. Miks peab PCR-il kasutama kahte praimerit? DNA-l on kaks ahelat. 17. Miks peab PCR-il kasutama termostabiilset DNA polümeraasi? DNA denatureeritakse 94-98 kraadi juures. Tavaline polümeraas denatureerub. 18. Miks valmistatakse elektroforeesi puhul geel puhvris, mitte tavalises vees? pH stabiilsuse tagamiseks, PCR toimub ainult kindlal pH-l. 19. Kuidas eristada DNA-fragmente geelelektroforeesil? Molekulid tuleb geelis nähtavaks tuua. Agaroosi kasutatakse maatriksina. 20. Miks voolutatakse geelelektroforeesil paralleelselt reeglina ka suurusmarkerit? Suurusmarker koosneb kindlaksmääratud suurusega molekulide segust, saab määrata meie proovi molekuli suurust. 21
pinnaga vahetult kontaktis olevad lahusti molekulide kihid on tema suhtes paigal ning võtavad koos kolloidosakestega osa Browni liikumisest. zeta potential is electric potential in the interfacial double layer (DL) at the location of the slipping plane versus a point in the bulk fluid away from the interface. In other words, zeta potential is the potential difference between the dispersion medium and the stationary layer of fluid attached to the dispersed particle. 6. Elektroforeesi kasutamine elektrokineetilise potentsiaali määramiseks Selle põhjal, kui palju kolloidlahus on elektriväljas liikunud, ja kui palju on selleks aega kulunud, leitakse kaksikihi edasi liikumise kiirus ning selle põhjal arvutatakse elektrokineetiline potentsiaal. 7. Elektroosmoosi kasutamine -potentsiaali määramiseks. 8. Elektrolüütide mõju elektrilise kaksikkihi ehitusele ja -potentsiaalile. 15k Vedeliku viskoossuse temperatuuriolenevuse määramine 1
mis on suuteline sünteesima komplementaarset ahelat kõrgel temperatuuril (72ºC), samuti ei denatureeru ta korduvate tsüklite vältel 94ºC juures. Igast sihtmärk- DNA-st tekib esimese tsükli järel 2 ahelat, järgmises tsüklis tekib kahest ahelast 4, kolmanda tsükli ajal neljast ahelast 8 jne. Kasv toimub geomeetrilises progressioonis. 30-40 tsükli vältel tekib 107-108 uut koopiat. PCR PRODUKTI DETEKTEERIMINE toimub geel-elektroforeesiga. Peale elektroforeesi geel värvitakse etiidiumbromiidiga, mis DNAga seostudes helendab UV kiirtes. Elektroforeesi teostamisel lisatakse geelile molekulmassi marker, mis on kommertsiaalsed DNA fragmentide segud, mille iga lõigu pikkus on teada. Võrreldes amplikoni paiknemist molekulmassi markeri bändide suhtes on võimalik ligikaudselt hinnata amplikoni suurust. Joonis 2. PCR põhimõtteline skeem. (A) Esimeses
Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt eraldatud/puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis). Ei teinud, sest lahus oli piisavalt puhas. (10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust: 2-3 l DNA-d 2,5 l DNA-d + 10 l 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla) Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse ,,hambasse" ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. 9 1kb 1kb Kristine Arvidas Hannes Oksana Marker Marker MihkelMihkel HeleenHeleen KseniaKsenia MarkoMarko JelenaJelena Doris Doris Mikk Mikk Anna Anna Alex Alex Aare Aare Irina Irina Inna Inna Jana Jana Karl Karl Kristine Arvidas Hannes Oksana Marker Marker
oligonukleotiidid, mida kasutatakse PCR-is. Praimer on lühike (tavaliselt umbes kümme aluspaari pikkune) nukleiinhappe lõik, mis on DNA replikatsiooni alguskohaks. 20. Kes töötas välja PCR meetodi? 2:2-3. PCR meetodi leiutas 1983 Kary Mullis. 21. Mis on geel-elektroforees ja milleks seda kasutatakse? 2:11-15. Elektroforees on meetod mis võimaldab eri tüüpi molekule üksteisest lahutada järgnevate karakteristikute järgi: elektriline laeng, suurus, kuju. Geel-elektroforeesi kasutatakse DNA molekulide isoleerimiseks. Geeliks kasutatakse agarist puhastatud suhkrut agaroosi. Agaroosil on poorjas struktuur mis takistab DNA fragmentide vaba liikumist ja seega lahutab DNA fragmendid vastavalt nende suurusele, st väiksemad molekulid liiguvad kiiremini ja jõuavad kaugemale kui suuremad. Pärast geel eletroforeesi kasutamist saab dna fragmente: PCR-iga paljundamine, kloneerimine vektoritesse, geeni-raamatukogus säilitamine, mikrokiibi analüüs,
kromatogrammil. 48. Elektroforees - elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Kui osakesed liiguvad elektriväljas katoodile, on see kataforees, kui anoodile, siis anaforees. Seda omadust, et erisuguse suuruse ja laenguga osakesed liiguvad elektroodide vahel erineva kiiruse ja suunaga, rakendatakse aineosakeste üksteisest eraldamiseks vastavalt nende laengule või suurusele. Elektroforeesi kasutatakse nt valkude ja DNA-analüüsis. 49. Nukleiinhapete hübridiseerimine In situ hübridisatsiooni (ISH) põhimõte on fikseeritud koetükis märgistatud nukleiinhappe (DNA või RNA) ahela kinnitamine komplementaarse DNA või RNA ahela külge. Seda tehakse kuumutamisega, millele järgnevalt tuvastatakse vaatlusega uuritava sondi ehk märgistatud ahela asukoht. Seda meetodit saab kasutada selleks, et
Milleks kasutatakse bioloogias tsentrifuugimist? Kasutatakse väikeste koguste bioloogiliste molekulide eraldamiseks ja koostise uurimiseks. Tsentrifugaaljõudu kasutatakse bioloogiliste osakeste koostise uurimiseks. Selle abil saab eraldada nt. ribosoome, proteiine ja viirusi, samuti uurida rakumembraani kihte. Saab nt. kindlaks teha missugustest aminohapetest koosneb valk jne. Molekulid kas lahustuvad tsentrifuugi käigus, vajuvad põhja või moodustuvad kihid. Geel-elektroforees on elektroforeesi rakendus, mida kasutatakse erinevate elektriliselt laetud molekulide (DNA, RNA, valgud) eraldamiseks pikkuse, laengu või konformatsiooni järgi agaroosist. Negatiivselt laetud nukleiinhapete (DNA, RNA) molekulid liiguvad agaroosgeelis elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile, agroosis peatuvad pikemad molekulid lähemal alguskohale (hambale). Lisaks molekulide erinevale suurusele mõjutab nende liikumist ka konformatsioon – tsirkulaarsed molekulid liiguvad kas aeglasemalt või
48.Elektroforees Makromolekulide separeerimine elektriväljas. Kolloidosakeste ja makroioonide liikumine elektrvälja mõjul katoodile(kataforees) või anoodile (anaforees). Seda põhjustab osakeste elekrilaeng, mis kolloidosakeste puhul tuleneb osakeste tuumadel absorbeerunud ioonidest. Elektroforees võib toimuda ka lahustiga immutatd kandmaterjalil- filterpaberil(paberelektroforees) või geelil(geelelektroforees). Elektroforeesi rakendatakse metallide pinnale kolloidosakestest kattekihi tekitamiseks, kõrgmolekulaarsete ühendite (nt valkude) segude analüütiliseks lahutamiseks, meditsiinis jms. 49. Nukleiinhapete hübridiseerimine. Kui segada üheahelalisi DNA või RNA järjestusi, millel on omavahel komplemen-taarseid järjestusi, siis need piirkonnad paarduvad vastavalt komplementaarsuse printsiibile, moodustades DNA-DNA või DNA-RNA kaksikheeliksi
esindatud nii positiivselt kui negatiivselt laetud rühmad, eksisteerib ka pH väärtus, mille juures molekulide keskmine laeng on null ehk molekulil esineb isoelektriline punkt. Kui molekulis domineerivad happelised rühmad on pI madal, kui aga domineerivad aluselised rühmad on pI kõrge. Konkreetse valgu pI väärtus on seda valku iseloomustavaks suuruseks. Amfolüütide ja polüamfolüütide pI on võimalik määrata eksperimentaalselt. Selleks kasutatakse elektroforeesi pH gradiendis ja seda nimetatakse isoelektriliseks fokuseerimiseks. Elektrivälja toimel amfolüütide lahusele hakkavad summaarset positiivset laengut kandvad molekulid liikuma katoodile (katioonid liiguvad katoodile) ja negatiivset kogulaengut kandvad molekulid liiguvad anoodi suunas (anioonid liiguvad anoodile). Isoelektrilises punktis on molekulide keskmine laeng null ja seetõttu nad elektriväljas ei liigu. Kuna elektroforees viiakse
mitmesuguseid raku omadusi. Plasmiide kasutatakse siis kui nt tahetakse viia mõnd geeni teise organismi või tahetakse toota nt mõnd valku. 40. DNA kloneerimise etapid. 41.DNA sekveneerimine. Järjestuse määramine. Praegu on kasutusel ensümaatiline meetod, kus DNA polümeraas lisab vahetevahel ahela sünteesi käigus dNTP asemel didesoksünukleotiidi, mis lõpetab antud ahela pikenemise. Märgistatud DNA aheladtuvastatakse geel-elektroforeesi pikkuse järgi. 42.Polümeraasi ahelreaktsioon. PCR. Võimaldab eksponentsiaalselt paljundada uuritavad DNA-d. Põhineb: termostabiilne DNA polümeraas; komplementaarsed praimerid meid huvitavale järjestusele; tsükleerimine (ahelate lahtisulatamine 95o 20 s; praimerite paardumine 50-650 20 s; ahelate sünteesimine 72o 1 min; seda kokku 30-40 korda). 43.Elektroforees. 44.Nukleiinhapete hübridiseerimine. Kindla NA järjestuse tuvastamine NA
a viimases etapis; nakatund rakud ei puhune ja proinflammatoorseid tsütokiine ei vabane; E6 ja E7 blokeerivad immuunsüsteemi. 21. Mis on hospitaalinfektsioonid? Kuidas neid diagnoosida? Molekulaardiagnostika on täiesti asendamatu hospitaalinfektsioonide puhul. Neid on 2 tüüpi: need, mis on pidevalt haiglas olemas ja need, mis tuuakse sinna teiste inimestega sisse. Hospitaalinfektsioonid on haiglaspetsiifilised, selle tuvastamiseks kasutatakse Pulse-Field elektroforeesi. Nii saab suuri DNA fragmente paremini lahutada. 22. Milline on HI-viirusega nakatumise tõenäosus? Millest see sõltub? Suguline: naiselt mehele 1/700 - 1/3000 mehelt naisele 1/200 - 1/2000 mehelt mehele 1/10 - 1/1600 fellatsioon - 1/16 Parenteraalne: nakatund verega - 95/100 nakatund süstlaga - 1/150 Emalt lapsele AZT ravita - 1/4 AZT ravi foonil 1/10
H3 – raskete ahelate variaablid. Loopid. Seondumine ei ole kovalentne aga on väga tugev. Vereseerumis on kõige rohkem albumiini valku, kuidas lahutada valgud? Lahutamine sõötub nende isoelektrilisest täpst. Albumiini isoelektriline täpp on happelises piirkonnas. Isoelektrriline täpp – pH väärtus kui tema laeng on null. Albumiiin liigub kiirelt siis. Grupp valke mis liigub vähe, isoelektriline punkt pH 8. Gamma globuliini mõiste on seotud elektroforeesi tehnikaga. Inimese viis erinevat klassi antikehasid, eri tüüpi raske ahel. IgM tüüpi antikegadel (ja IgA tüüpi) on peale raskete ja kergete ahelte veel J-segment valk (ahel)?? esimene antikeha mida sekreteeritakse on IgM, kui patogeen ründab. Saa kindlaks teha nt kui millal borrelioos ründas, IgM tekib algul ja mõne nädala jooksul langeb ja toimub ümberlülitumine IgG tüüp antikehadele. IgE tüüpi seotud ülitundlikkusreakstioonidega
Elektroforees (elektro + kr phoros kandev) on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Seda omadust, et erisuguse suuruse ja laenguga osakesed liiguvad elektroodide vahel erineva kiiruse ja suunaga, rakendatakse aineosakeste üksteisest eraldamiseks vastavalt nende laengule või suurusele, ka sõltuvalt molekulide pikkusest. Elektroforeesi kasutatakse nt valkude ja DNA -analüüsis, elektroonilise paberi tehnikas, samuti metalli pinnale kolloidosakestest kattekihi tekitamiseks 11. Nukleotiidid Nukleotiidid on nukleiinhappe monomeerid. Nad on nukleosiidide mono-, di- või trifosfaatestrid. Riboosi/desoksüriboosi esterifitseerumine fosforhappejäägiga annab ribonukleotiidi/desoksüribonukleotiidi. Mononukleotiidid võivad olla mono-, di- või trifosforüülitud. DNA-s võivad esineda nukleotiidid:
ja afiinsuskromatograafia) põhimõte. Ioonvahetuskromatograafia – positiivselt laetud kerakestele seostuvad negatiivselt laetud molekulid. Positiivselt laetud molekulid ei seostu ja tulevad kolonnist läbi. Geelfiltratsioonkromatograafia – väiksed molekulid takerduvad poorsetesse kerakestesse, suured läbivad kolonni vabalt. Afiinsuskromatograafia – keraksetega kovalentselt seotud molekulidele seostuvad neile spetsiifilised molekulid. SDS-polüakrüülamiidgeel elektroforeesi tööpõhimõte. Proov geelile, valgud liiguvad + poole, saab hinnata valkude suurust Valkude ülekanne SDS-polüakrüülamiidgeelilt membraanile ning nende tuvastamine antikehade abil. Geelilt kantakse membraanile, inkubeeritakse antikehadega, loputatakse, inkubeeritakse ensüümiga, loputatakse, kromogenne dekteteerimine Kahedimensionaalse geelelektroforeesi põhimõte. Proteiini segu isoelektriline fokuseerimine, esimene geel teise peale ja SDS elektroforees Erinevad koetüübid.
Analüütide määramiseks kasuta- Kasutatakse mitmesuguseid Kasutatakse matemaatilise statis- takse spetsiifilisi keemilisi aparaate ja instrumente. tika meetodeid, et kavandada reagente ja testreaktsioone ning Enimkasutatavad on kromato- optimaalseid eksperimendi prot- meetodeid nagu mahtanalüüs graafia meetodid, spektraalmee- seduure ja ekstraheerida mõõt- (tiitrimine) ja kaalanalüüs. Kasuta- todid, elektroforeesi meetodid jt. mistulemustest maksimaalset takse ka füüsikalis-keemiliste Kaasaegses analüütilises keemias infot proovi koostise kohta. karakteristikute (sulamistempera- domineerivad just tundlikul tuuri, keemistemperatuuri, tihe- aparatuuril põhinevad meetodid, duse, murdumisnäitaja) määra- sealhulgas kombineeritud misandmeid. (hübriid-) tehnikad. Komplitseeri-
rakk laguneb membraaniga ümbritsetud vesiikuliteks. Apoptoosi tuvastamine 1. DNA ahelate katkemise tuvastamine terminaalse desoksünukleotidüül transferaasi (TdT) abil, nn. TUNEL meetod. See ensüüm lisab DNA-s olevate nukleiinhapete 3’-OH otstesse dUTP-d (deoksüuridiin trifosfaat). 2. Apoptootilistel rakkudel paikneb fosfatidüülseriin plasmamembraani tsütosooli poolselt küljelt rakuvälisele poolele. Fosfatidüülseriiniga seostub anneksiin. 3. DNA fragmentide tuvastamine geel-elektroforeesi abil. 27. Rakkude diferentseerumine ja selle üldpõhimõtted DNA metüleerimine ja geenide vaigistamine, pluri-, multipotentsed tüvirakud ning embrüonaalsed tüvirakud). Indutseeritud pluripotentsed tüvirakud. Diferentseerumine on protsess, mille käigus vähespetsialiseerunud rakk muutub kõrgesti spetsialiseerunud rakuks. Diferentseerumise protsessile on iseloomulik: 1. Geenide valikuline ekspressioon.
Laktoospositiivsete salmonellade detekteerimiseks on loodud mannitool-lüsiin- kristallviolett-briljantrohelise agar. Salmonelladele iseloomulikud tüved tuleb lõplikult kinnitada biokeemiliste ja seroloogiliste testidega. Täiendavate epidemio- loogiliste uuringute eesmärgil saab tüvesid omakorda tüpiseerida, kasutades faag- 43 tüpiseerimist, pulseeriva välja geel-elektroforeesi jt. Tabel 3.3 iseloomustab erinevaid salmonellade isoleerimiseks kasutatavaid söötmeid. Tabel 3.3. Söötmed salmonellade isoleerimiseks Inkubeerimine Toiming Sööde Temp °C Kestus h Eelrikastamine Puhverdatud peptoonvesi 37 1620
sisse, puudub kontsentratsioonigradient ning difusiooni ei esine. Uuritava kontsentratsiooniga komponent asetatakse geeli süvenditesse, uuritav komponent hakkab difundeeruma kontsentratsiooni vähenemise suunas. Seos kontsentratsiooni languse ja difundeerumisraadiuse vahel on logaritmiline, kusjuures ka mõõtmisviga võimendub logaritmiliselt. Kolmandaks immuundifusiooni meetodi võimaluseks on selle kombineerimine elektroforeesiga. Selle juures eristatakse immuno-, rakett- ja vastuvoolu elektroforeesi. Immuundifusioonimeetodite analüütiline tundlikkus on tagasihoidlik, vajab mõlemat reaktsioonipoolt küllaltki suures koguses. Antigeenide määramine veres ja kudedes: Turbido- ja nefelomeetrias mõõdetakse immuunreaktsioon valguse hajumise fenomeni kaudu. Nefelomeetrias lahuse hägususe suurenedes valgusvoog detektorisse suureneb. Turbidomeetrias lahuse hägususe suurenedes valgusvoog detektorisse väheneb. Neid meetodeid kasutatakse
annaabi.ee 
