1. Kandsime ettevalmistatud valguproove ettevaatlikult geelitaskutesse (20 l). Protokollisime, millisesse taskusse, millise proovi kandsid. 2. Asetasin foreesivannile kaasi, ühendasime juhtmed vooluallikaga ning lülitasime vooluallikas sisse (pinge 180V, voolutugevus 30 mA). NB! Täida elektriaparaatidega töö ohutuseeskirjasid! 3. Foreesi viiakse läbi üldjuhul niikaua, kuni markerina kasutatav broomfenoolsinine on geeli lõpuni jõudnud (tavaliselt ~1 tund 180 V juures). Elektroforeesi kulgu tuleb jälgida ning tuleb veenduda, et geel üle ei kuumeneks (alanda pinget 150V-ni). 4. Lülitasime foreesiaparaat elektrivõrgust välja, kogu puhvrivannidest puhver kokku ja valasime tagasi puhvri pudelisse, võtsime geeli aparaadist välja, eraldasime klaasplaadid teineteisest väga ettevaatlikult kasutades väikest spaatlit. 5. Panime geeli ööseks Coomassie G250 värvilahusesse. 6. Saime elektroforeesi tulemust : Lahtrites vasakust paremale : 1. Marker 2
TTÜ Füüsikalise keemia õppetool KOLLOIDOSAKESTE ELEKTROKINEETILISE Töö nr: 6/9 POTENTSIAALI ELEKTROFOREETILINE MÄÄRAMINE Liis Hendrikson KATB 41 Teostatud: Kontrollitud: Arvestatud: 28.03.2012 Joonis . Elektroforeesi uurimise seadme põhimõtteskeem 6. SOOLI VALMISTAMINE Töö ülesanne Valmistada raudhüdroksiidi kolloidlahus. Määrata kolloidosakeste laengumärk ja potentsiaal elektroforeesi teel. Töö käik Raudhüdroksiidi sooli võib saada, kui intensiivsel segamisel juhtida 10 ml 2% värskeltvalmistatud lahust 250 ml keevasse vette. Toimub hüdrolüüsireaktsioon:
füüsikalise keemia õppetool Töö nr: 6/9k Töö pealkiri: Fe(OH)3 sooli valmistamine/ Kolloidosakeste elektrokineetilise potentsiaali elektroforeetiline määramine Üliõpilase nimi ja eesnimi: Õpperühm: Töö teostamise Kontrollitud: Arvestatud: kuupäev: 13.02.2012 SKEEM Elektroforeesi uurimise seadme põhimõtteskeem Töö eesmärk: Uurida elektroforeesi nähtust, mtes piirpinna kolloidlahus- dispersioonikeskkond liikumise joonkiirust. Selle phjal määrata osakeste laengu märk ja arvutada elektrokineetiline potentsiaal ( - potentsiaal). Töö käik: Kõigepealt valmistada raudhüdroksiid sool, mida saab teha intensiivsel segamisel juhtides 10ml 2% värskelt valmistatud FeCl3 lahust 250ml keevasse vette. Seejärel võtakse
füüsikalise keemia õppetool Töö nr: 6/9k Töö pealkiri: Fe(OH)3 sooli valmistamine/ Kolloidosakeste elektrokineetilise potentsiaali elektroforeetiline määramine Üliõpilase nimi ja eesnimi: Jekaterina Miloserdova Õpperühm: KATB47 Töö teostamise kuupäev: Kontrollitud: Arvestatud: 17.03.2014 Töö eesmärk: Uurida elektroforeesi nähtust, mtes piirpinna kolloidlahus- dispersioonikeskkond liikumise joonkiirust. Selle phjal määrata osakeste laengu märk ja arvutada elektrokineetiline potentsiaal ( - potentsiaal). Töö käik: Kõigepealt valmistada raudhüdroksiid sool, mida saab teha intensiivsel segamisel juhtides 10ml 2% värskelt valmistatud FeCl3 lahust 250ml keevasse vette. Seejärel võtakse kasutusse elektroforeesi uurimise seade, mille külgtoru täidetakse Fe(OH)3 kolloidlahusega, U-
polümeriseeruvad väga kiiresti. Paneme kokku vajaliku aparatuuri ja lisame kahe klaasi vahele alumist geeli. Siis lisame natuke vett selleks, et geel tarduks kõikides kohtades ühtlaselt. Kui alumine geel on tardunud valame vee välja, lisame ülemise geeli tuubi TEMED-i ja valame kahe klaasi vahele. Paneme hambad peale ja ootame, kuni geel tardub. Kui geel on tardunud võtame hambad ja klaasid ära ning paneme geelid elektroforeesi vanni. Lisame vanni Running puhvrit. Kanname 10 µl proovi geelile, järjekorras: 1proov; 2proov;Markes; 1proov; 2proov; 100 marker; 250 marker; 500 marker; Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min. (läks natuke kauem) Geel 1 2 M 1 2 100 250 500 Ülemine osa(4%) Alumine osa(10%)
Kolloidosakeste elektrokineetilise potentsiaali elektroforeetiline määramine Üliõpilase nimi ja Õpperühm eesnimi Töö teostamise Kontrollitud: Arvestatud: kuupäev: 09.03.2011 Joonis Elektrofereesi uurimise seadme põhimõtteskeem Fe(OH)3 SOOLI VALMISTAMINE TÖÖ EESMÄRK Valmistada raudhüdroksiidi kolloidlahus. Määrata kolloidosakeste laengumärk ja - potentsiaal elektroforeesi teel. TÖÖVAHENDID FeCl3 2% värskelt valmistatud lahus, keeduklaasid, pipetid. TÖÖ KÄIK Raudhüdroksiidi sooli vib saada, kui intensiivsel segamisel juhtida 10 ml 2% värskeltvalmistatud FeCl3 lahust 250 milliliitrisse keevasse vette. Toimub hüdrolüüsireaktsioon FeCl3 + 3H2O = Fe(OH)3 + 3HCl Raudhüdroksiidi raskestilahustuvad molekulid moodustavad omavahel ühinedes osakese tuuma. Ionogeense rühma annavad raudoksükloriidi molekulid, mis tekivad tuuma molekulide
TTÜ Materjaliteaduse Instituut Füüsikalise keemia õppetool Töö nr 6/9k Kolloidosakeste elektrokineetilise potentsiaali elektroforeetiline määramine Joonis 1. Elektroforeesi uurimise seadme põhimõtteskeem Fe(OH)3 SOOLI VALMISTAMINE Töö eesmärk Töös on vaja valmistada raudhüdroksiidi kolloidlahus. Määrata kolloidosakeste laengumärk ja ζ - potentsiaal elektroforeesi teel. Töövahendid FeCl3 2% värskelt valmistatud lahus, keeduklaasid, pipetid. Töö käik Raudhüdroksiidi sooli saab, kui intensiivsel segamisel juhtida 10 ml 2% värskelt valmistatud FeCl3 lahust 250 milliliitrisse keevasse vette. Toimub hüdrolüüsireaktsioon FeCl3 + 3H2O = Fe(OH)3 + 3HCl Raudhüdroksiidi raskestilahustuvad molekulid moodustavad omavahel ühinedes osakese tuuma
· Kui geel on tardunud, võtame kammi ära ning saame kammi hammastesse oma proovid lisada. Lisame vanni Running puhvrit. · Kanname 10 µl proovi geelile, järjekorras: 1) Proov 1-kontrollproov 2) Proov 2-üleekspresseerunud valguga 3) Marker suuruse määramiseks 4) Proov 1 5) Proov 2 6) PSA kontsentratsiooni määramiseks 100 µg/µl 7) 250 µg/µl 8) 500 µg/µl · Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min. Geel 1 2 M 1 2 100 250 500 · Pärast elektroforeesi toimumist võtame geeli välja ja lõikame ülemise osa ära. Alumise osa lõikame markeri keskelt pooleks- väiksem osa läheb immunoblotti ja suurem osa värvimiseks. Geeli värvimine · Suurema osa geeli värvime seguga:
Kui alumine geel on tardunud valame vesi välja ,lisame ülemise geeli tuubisse TEMED-i ja valame kahe klaasi vahele. Paneme ,,kamm" peale ja ootame ,kuni geel tardub. · Kui geel on tardunud võtame ,,kamm" ära, seejärel võtame klaasid ära ja paneme geelid freesi vanni. Lisame vanni ,,Running ,,puhvrit. · Kanname 10 µl proovi geelile, järjekorras: 1; 2;M; 1; 2; 0,5; 1; 1,5; · Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min. Geel 1 2 M 1 2 0,5 1 1,5 · Pärast elektroforeesi toimumist võtame geel välja ja lõikame pooleks. Väiksem osa läheb immunoblotti ja suurema osa värvime. Geeli värvimine. · Suurema osa geeli värvime seguga: 25% isopropanool, 7% äädikhape, 0,1% Commasie Blue R.
Fifth level Defektse alleeli tuvastamine märgistatud DNA-proovi abil Uuritava kromosoomi DNA denatureeritakse ja lisatakse teadaolevale mutatsioonipiirkonna järjestusele komplementaarsed DNA proovid. DNA-proovi seostumine kromosoomis on tuvastatav neil oleva märgise järgi DNA-sõrmejälgede metoodika Iga inimese sõrmejäljed on kordumatud DNA-fragmentide pikkuserinevused annavad DNA elektroforeesi käigus mustri,mis on individuaalselt sama kordmatu kui tõelised sõrmejäljed. DNA-restriktsioonanalüüs:DNA-sõrmejäljed Bioloogilisest proovist(veri,koetükk,sperma vms)eraldatakse rakutuumad DNA eraldatakse tuumadest ning restriktaaside abil lõigatakse DNA eri pikkusega lõikudeks Ühesuguse pikkusega DNA-lõigud paigutuvad eletroforeesi käigus ühte piirkonda.Eri inidviidide fragmendipikkuste muster-"sõrmejäljed"-on erinevad Polümeeraasne ahelreaktsioon
MATERJALITEADUSE INSTITUUT FÜÜSIKALISE KEEMIA ÕPPETOOL Üliõpilane: Teostatud: Õpperühm: Kontrollitud: Töö nr: 6/9K Kaitstud: Fe(OH)3 SOOLI VALMISTAMINE KOLLOIDOSAKESTE ELKTROKINEETILISE POTENTSIAALI ELEKTROFOREETILINE MÄÄRAMINE SKEEM Tööülesanne: Uurida elektroforeesi nähtust, mtes piirpinna kolloidlahusdispersioonikeskkond liikumise joonkiirust. Selle phjal määrata osakeste laengu märk ja arvutada elektrokineetiline potentsiaal ( - potentsiaal). Töö käik: külgtoru täidetakse juhendaja poolt määratud kolloidlahusega, U-torusse kallatakse umbes 15 ml külgvedelikku ja asetatakse kohale CuSO4-ga täidetud vahelahused. Seejärel asetatakse kohale soolasillad ja Cu-elektroodid, mis ühendatakse alalisvoolu toiteallikaga
ja kuumutades, kindlaid DNA piirkondi Iga tsükliga kahekordistub algne DNA matriitsjärjestus Enam kui kahe DNA piirkonna samaaegset kopeerimist tuntakse multipleks-PCR-i nime all. DNA analüüs isikutuvastamiseks kasutatakse enamasti lühikesi kordusjärjestusi ehk STR lookusi, mille alleelid erinevad üksteisest pikkuse osas, seega ei ole vaja määrata DNA nukleotiidide järjestust, vaid kopeeritud DNA lõikude pikkusi Selleks kasutatakse elektroforeesi DNA analüüs Kuna aga multipleks-PCR-i kaudu paljundatud DNA fragmendid on siiski küllalt lähedase pikkusega, kasutatakse nende täiendavaks eristamiseks fluorestseeruvaid värve, mis on ühendatud reaktsiooni läbiviimiseks kasutatavate praimeritega Kõik algselt matriitsilt kopeeritud DNA-lõigud muutuvad värviliseks ning visualiseeritakse värviliste piikidena elektroferogrammidel DNA analüüs Viimane etapp seisneb tulemuste
detekteerida kõiki aineid mis kiirgavad fluorestsensi. - Juhtivusdetektor - hea selektiivsus - hea tundlikkus - mõõdetakse ioniseeritud analüüte. - Elektronkeemiline detektor - hea selektiivsus - suurepärane tundlikkus - mõõdetakse elektrivoolu mis tekib redoksreaktsioonide tulemusena. - Massispektromeetriline detektor - suurepärane selektiivsus - suurepärane tundlikkus - proov ioniseeritakse ja mõõdetakse massi/laengu suhet. 35. Elektroforeesi definitsioon Elektroforees - laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul. 36. Elektroosmootse voolu teke Pingestatud kapillaartorus ei hakka liikuma ainult analüüsitavad ioonid vaid ka taustelektrolüüt/puhver. Pingestamisel hakkavad lahuses olevad prootonid liikuma katioodi poole => prootonid on solvateerunud ehk ümbritsetud vee molekulide kihiga ja tõmbavad oma liikumisel kaasa kogu puhvri, seega voolab puhver nii öelda anoodilt katoodile. 37
fragmenti, dNTP olemasolul võib sünteesida kaksikahelat. Seda sünteetilist järjestus amplifitseeritakse PCR abil, lisades praimeri (forward ja reverse), Mg (katalüsaator), dNTP-d, Taq polümeraasi (teostab sünteesi kõrgel temperatuuril). PCR käigus toimub ahelate denatureerimine, praimeritega seondumine ja süntees. Seda tsüklit korratakse 30 korda. Seda etappi kontrollitakse kasutades elektroforeesi. Järgmisena toimub selle järjestuse ja vajaliku vektori töötlemine. Sõltuvalt sellest, mis otsad tahetakse saada (,,blunt" või ,,sticky") kasutatakse vastavalt vajalikud restriktaase. Lõigatakse sama restriktaasidega nii vektorit kui ka järjestust. Puhastatakse saadu produktid. Siis ligeeritakse vektorisse saadud järjestust (takistades ise-ligeerimist, kasutades nt. defosforüülimist). Siis teostatakse vektori transformeerimine bakterirakku, kus huvipakkuva
- eemalda supernatant - pesemiseks lisa sademele ~200 l 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min 7 Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt eraldatud/puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis). (10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust: 10 l DNA-d + 2,5 l 5 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla) Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse ,,hambasse" ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. Elektroforeesi tulemused: Lisaülesanded: 3.1) Võrdle antud protokolli DNA kokaraamatus tooduga (vt. lisa). Millised etapid on samad, millised erinevad? Sinu arvamused, ettepanekud, küsimused? Kokaraamatus lisatakse lahust III 150µl ,me lisasime lahust III 400µl. Kokaraamatus lisatakse lahust I 100 µl, me lisasime lahust I 200µl. 3.2) Kui palju tuleb võtta RNaasA-d, mille algkontsentratsioon on 10 mg/ml, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5 ng/l 1 ml-s TE-s
Taolise probleemi ärahoidmiseks kasutatakse proovi ettevalmistamise käigus redutseerivat agenti dithiothreitol (DTT või Clealand`i reagent) või 2-merkaptoetanooli (2-ME). Redutseerivates tingimustes lagunevad disulfiidsidemed ning disulfiidseotud valkude oligomeerid algunevad. „Plaat” geeli vorm koosneb kahest paralleelsest klaasplaadist või plastiklehest, mille vahele on asetatud tihendid (spacerid) vahemiku tekitamiseks ning geeli äravoolu takistamiseks servadest. SDS-PAGE elektroforeesi puhul kasutatakse kihilist kahe geeli kombinatsiooni. Esmalt valatakse kahe plaadi vahele lahutav geel ning järgnevalt kontsentreeriv geel. Kontsentreerivasse geeli asetatakse enne polümeriseerumist kammid, mille abil tehakse geeli taskud proovide jaoks. Lahutav ja kontsentreeruv geel erinevad puhvri konsentratsiooni ja pH poolest. Pinge sisselülitamisel liiguvad anioonid anoodile (alumine elektrood) ning katioonid katoodile (ülemine elektrood)
regulaatorelementi sisaldavat DNA fragmenti, mis on eelnevalt radioaktiivselt märgitud. Lane 1 is a negative control, and contains only DNA. Lane 2 contains protein as well as a DNA fragment that, based on its sequence, does not interact. Rida 3 sisaldab valku ja DNA fragmenti, mis reageerib. Saadud kompleks on suure, raskem ja aeglasem. Muster real 3 on sellisel juhul kui kogu DNA oleks seotud ja elektroforeesi ajal ei toimunud üldse kompleksi dissotsieerumist. Kui need tingimused ei ole täidetud, siis võib seal olla ka teine band, (real 3), mis tähendaks vaba DNA olemasolu või DNA-valk kompleksi dissotsieerumist. Valgule võib lisada ka veel antikeha, mistõttu moodustub veel suurem kompleks ja ta liigub veel vähem.
kordusjärjestused. SNP - ühenukleotiidne erisus/varieeruvus. (vt: http://www.haridustehnoloogid.ee/veebiseminarid/30-veebiseminar-ulevaade- dna-st-ja-isiku-tuvastamisest/). Isiku tuvastamiseks tuleb võtta proov (sülg, veri jne), seejärel eraldatakse DNA. Hinnatakse kvaliteeti ja kogust ning paljundatakse PCR meetodil. DNA sõrmejälje metoodika- DNA-fragmentide pikkuste erinevused annavad elektroforeesi käigus mustri, mis on kordumatu kui sõrmejälg.
Nii jõuavad ained stardijoonest erinevatele kaugustele. Eristamiseks kasutakse ultraviolettlambi või kemikaali lahused. 12. Elektroforees Laetud osakesed liikumine elektriväljas alusel. Liikumine sõltub elektrilisest potentsiaalist ja summaarlaengust. Valkudel on erinev summaarlaeng, lahustavad naj elektriväljas. Levinum on geel-elektroforees. Lahustatavad komponendid jaotuvad liikuvuse alusel kandjal kitsaste vööndidena,mis on vaja indifitseerida. Geel-kandjate poorne struktuur tagab elektroforeesi suurema kiiruse ja lahutusvõime. Reguleerib valgumolekulide liikumist sõltuvalt mõõtmetest ja Mr-st. Kõike efektiivne on PAGE, kus PAAG toimib poorse molekulaarsõelana. Seal baseerub kõrglahustusvõime geeli poorsusel ka pH gradiendil. Elektriväljas lahutunud uuritava segu bändi(väiksed liiguvad kiiresti,suured ei) imutatakse värvimisega. Värvained seonduvad üskne lahutunud komponentidega. PAGE kasutakse kui väga detailse proteinogrammi saamiseks 13
lahutuse asendada lihtsalt massi alusel lahutuvusega. Kasutusel valkude ja DNA puhul. Kapillaar isoelektriline fokuseerimine (CIEF) - kasutab pH gradienti katoodi ja anoodi vahel, amfoteersed molekulid a la valgud migreeruvad kohta, kus nende laeng on null, selles punktis liikumine lõpeb ja analüüt fokuseerub kintsasse tsooni oma isoelektrilises punktis. Kasutatakse valkude kirjeldamises. Proteiinide kahemõõtmeline elektroforees ja SDS-PAGE olemus. SDS; elektroforeesi läbiviimine sõltub pH-st, valgu aminohappelisest koostisest, st laengust. Valgud lõhutakse merkaptoetanooliga, lõhutakse SDS-ga (dodetsüülsulfaat) nii, et laeng muutub võrdeliseks molekulkaaluga (1 SDS 2 AH kohta), misläbi valk muutub vardakujuliseks, liikudes aeglasemalt geelil oma pikkuse tõttu. Kahemõõtmelisus 1. IEF - lahutamine laengu järgi 2. SDS-PAGE - proovi lahutamine suuruse järgi SDS-PAGE eesmärk on lahutada valke suuruse alusel.
7 Vedeliku 6,5 viskoossus 6 mPas ln 5,5 741.7347616 5 331.5770293 4,5 172.5752824 4 88.78246991 0,00315 0,0032 0,00325 0,0033 0,00335 0,0034 1/T 14 316 033 0,00335 0,0034 Potentsiaalide vahe Elektroodide vaheline Piirpinna Elektroforeesi elektroodidel U kaugus L edasinihkumine aeg t h V m m s 150 0,233 0,005 1500 Külgvedeliku Külgvedeliku viskoossus dielektriline läbitavus Pa*s 0,8902 78,53 Jrk Lahuse normaalne Mõõdetud Elektrijuhtivus Ekvivalentjuhtivus nr
ATP roll: · ATP on kontraktsiooni vahetu energiaallikas: tema hüdrolüütilise lõhustumise energiamuut kasutub müosiinipeakeste liikumiseks (keemiline energia konverteerub mehhaaniliseks) · ATP hüdrolüütilise lõhustumise energiamuudu arvel eemaldab Ca-pump sarkoplasmast kaltsiumiioone (vastu kontsentratsioonigradienti) 6. Vereplasma valgud Vereplasma proteinogramm elektroforeesi abil eraldatud valgud. Jaotus: · albumiinid · globuliinid ( 1, 2, , ) Vereseerumis: Prealbumiin Albumiin 1-globuliinid (nt. 1-antiproteaas, 1-happeline glükoproteiin, -lipoproteiin) 2-globuliinid (nt. 2-makroglobuliin, haptoglobuliin, tseruloplasmiin, CRP) -globuliinid (nt. transferriin, C3-komplementfaktor, -lipoproteiin) -globuliinid (nt. IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) ( vereplasmas oleks ka fibrinogeen) Veres on albumiine rohkem. Väga kiiresti metaboliseeruvad valgud
11. Kes on GMO-d, kuidas ja miks neid luuakse? GMO- geneetiliselt muundatud organism, kunstlikult geenide manipulatsiooni teel loodud. Miks luuakse: odav, lihtsasti loodav, saagikus suur, kahjuritõrjetele mittetundlikud jne. 12. Milles seisneb geneetilise sõrmejälje idee ning isaduse ja isiku tuvastamine . Kuidas see metoodika töötab? Geneetilise sõrmejälje idee seisneb DNA-fragmentide pikkuses, mis annavad DNA elektroforeesi käigus mustri, mis on individuaalselt kordumatu. Tänu sellele saab tuvastada isa, paljastatakse kurjategijat, määratakse isikuid kindlaks jne.Sellega saab testida ka organidoonori koe sobivust patsiendile. 13. Millised on need anatoomilised (füsioloogilised) eripärad, mis eristavad inimest teistest loomadest (võrdlus teiste primaatidega)? Eripärad: Väga suur ajumaht Püstine kehahoiak
Geelfiltratsioon Ioonvahetuskromatograafia Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis. Isoelektriline fokuseerimine – elektroforeesi geeli on moodustatud pH gradient; sellel geelil liiguvad valgud seni, kuni on jõudnud sellise pH-ga geeli ossa, mis vastab nende isoelektrilisele puntkile (pI) e. kui valgu summaarne laeng muutub nulliks ja kui laeng on null ei ole võimalik enam elektriväljas edasi liikuda. α – heeliks – valgu helikaalne sekundaarstruktuur, mida stabiliseerivad keskteljega paralleelset asetsevad vesiniksidemed aminohapete amino ja karboksüülrühmade vahel.
03/12/09 Blottimine, hübridiseerimine. Eelkõige nukleiinhapete uurimisel. Hübridiseerimine on meetod, mis võimaldab nähtavaks teha, enda jaoks, in vivo olevaid molekule molekule, mis pole sünteeside käigus märgistatud. Nukleiinhapete märgistamine: kuskil on nukleiinhappe ahel, kui me teame millise järjestusega nukleiinhapet me otsime, siis peame omama otsitavale komplementaarset järjestust. On elektroforeesi geel, kuhu oleme lauhtanud mingisugused nukleiinhapped. Kõikkide radade peal on tuhandeid erinevaid nukleiinhapete molekule neid on nii pelju, et me ei erista neid üksteisest. Esitame küsimuse, et kas nende molekulide hulgas on konkreetne molekul, millel see järjestus, mis meid huvitab. Esiteks peame geelis olevad nukleiinhapped kätte saama nii, et nad oleksid endiselt üksteisest separeeritud. Selleks saame
Ravimid sisestamiseks Kolloidkeemia Kristian Leite 2012 Materjal/aine Kalju Lott 33. Aerosoolid. Vahud. Pulbrid. Aerosoolid, nende jaotus Aerosoolide korral on dispkeskkonnaks gaas. Kui disp. on vesi, siis nimetatakse uduks( 3 kuni 5). Kui tahke, siis suits(1 kuni 5) või tolm(5 kuni 6). Aerosoolide jaotumine Aerosoolid jaotuvad elektroforeesi teel. See on sarnane elektroforeesile kolloidosakeste jaoks. Jaotumise aluseks on komponentide erinev laeng. Aerosoolid jaotuvad termoforeesi teel. Temperatuuris jaotuvad nad erinevalt. Võib toimuda ka kondenseerumine, sellisel juhul külmale tahkele faasile. Osakesed liiguvad eelistatud madalama temperatuuri piirkonda. Fotoforeesi teel. OSakesed soojenevad erinevalt päikese käes, seeläbi liiguvad gaasis erinevasse piirkonda.
coli positiivse vastuse? Laktoos, β-D-glükuroniidid, briljantroheline, sapisoolad. 15. Kuidas käituda siis, kui E. coli tuvastamisel indooltest annab positiivse vastuse, kuid GUR aktiivsus puudub? gusA geen on defektne. 16. Miks peab PCR-il kasutama kahte praimerit? DNA-l on kaks ahelat. 17. Miks peab PCR-il kasutama termostabiilset DNA polümeraasi? DNA denatureeritakse 94-98 kraadi juures. Tavaline polümeraas denatureerub. 18. Miks valmistatakse elektroforeesi puhul geel puhvris, mitte tavalises vees? pH stabiilsuse tagamiseks, PCR toimub ainult kindlal pH-l. 19. Kuidas eristada DNA-fragmente geelelektroforeesil? Molekulid tuleb geelis nähtavaks tuua. Agaroosi kasutatakse maatriksina. 20. Miks voolutatakse geelelektroforeesil paralleelselt reeglina ka suurusmarkerit? Suurusmarker koosneb kindlaksmääratud suurusega molekulide segust, saab määrata meie proovi molekuli suurust. 21
pinnaga vahetult kontaktis olevad lahusti molekulide kihid on tema suhtes paigal ning võtavad koos kolloidosakestega osa Browni liikumisest. zeta potential is electric potential in the interfacial double layer (DL) at the location of the slipping plane versus a point in the bulk fluid away from the interface. In other words, zeta potential is the potential difference between the dispersion medium and the stationary layer of fluid attached to the dispersed particle. 6. Elektroforeesi kasutamine elektrokineetilise potentsiaali määramiseks Selle põhjal, kui palju kolloidlahus on elektriväljas liikunud, ja kui palju on selleks aega kulunud, leitakse kaksikihi edasi liikumise kiirus ning selle põhjal arvutatakse elektrokineetiline potentsiaal. 7. Elektroosmoosi kasutamine -potentsiaali määramiseks. 8. Elektrolüütide mõju elektrilise kaksikkihi ehitusele ja -potentsiaalile. 15k Vedeliku viskoossuse temperatuuriolenevuse määramine 1
mis on suuteline sünteesima komplementaarset ahelat kõrgel temperatuuril (72ºC), samuti ei denatureeru ta korduvate tsüklite vältel 94ºC juures. Igast sihtmärk- DNA-st tekib esimese tsükli järel 2 ahelat, järgmises tsüklis tekib kahest ahelast 4, kolmanda tsükli ajal neljast ahelast 8 jne. Kasv toimub geomeetrilises progressioonis. 30-40 tsükli vältel tekib 107-108 uut koopiat. PCR PRODUKTI DETEKTEERIMINE toimub geel-elektroforeesiga. Peale elektroforeesi geel värvitakse etiidiumbromiidiga, mis DNAga seostudes helendab UV kiirtes. Elektroforeesi teostamisel lisatakse geelile molekulmassi marker, mis on kommertsiaalsed DNA fragmentide segud, mille iga lõigu pikkus on teada. Võrreldes amplikoni paiknemist molekulmassi markeri bändide suhtes on võimalik ligikaudselt hinnata amplikoni suurust. Joonis 2. PCR põhimõtteline skeem. (A) Esimeses
Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt eraldatud/puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis). Ei teinud, sest lahus oli piisavalt puhas. (10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust: 2-3 l DNA-d 2,5 l DNA-d + 10 l 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla) Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse ,,hambasse" ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. 9 1kb 1kb Kristine Arvidas Hannes Oksana Marker Marker MihkelMihkel HeleenHeleen KseniaKsenia MarkoMarko JelenaJelena Doris Doris Mikk Mikk Anna Anna Alex Alex Aare Aare Irina Irina Inna Inna Jana Jana Karl Karl Kristine Arvidas Hannes Oksana Marker Marker
Bio- ja geenitehnoloogia eksami kordamisküsimused 1. Mis on rekombinantne DNA tehnoloogia, selle ajalugu, meetodid ja rakendused. Rekombinantse DNA tehnoloogia on tehnoloogia, mis võimaldab DNA'd sünteesida ja manipuleerida mittelooduslikul teel. Mikroobe on kasutatud toiduproduktide tootmiseks nagu leib, juust ja alkohol. Tuhandeid aastaid on kasutatud selektiivset ristamist nii taimede kui loomade puhul. 20ndal sajandil hakkasid teadlased ära kasutama bakterite loomulikku ainevahetust tootmaks tööstuslikul skaalal butanooli, atsetooni, antibiootikume. Tänapäeval on spetsiifilisi geene võimalik eraldada peaaegu ükskõik millisest doonororganismist (nagu nt inimene, taimed või bakterid) ning viia (kloneerida) see peaaegu ükskõik millise teise retsipient organismi genoomi. 1:9-12. 2. Kirjeldage võrdlevalt eu- ja prokarüootset geeni. Prokarüüotsel puuduvad intronid, DNA rõngaskromosoomina ehk plasmiidina, DNA ei ole liitunud valkudega, r...
kromatogrammil. 48. Elektroforees - elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Kui osakesed liiguvad elektriväljas katoodile, on see kataforees, kui anoodile, siis anaforees. Seda omadust, et erisuguse suuruse ja laenguga osakesed liiguvad elektroodide vahel erineva kiiruse ja suunaga, rakendatakse aineosakeste üksteisest eraldamiseks vastavalt nende laengule või suurusele. Elektroforeesi kasutatakse nt valkude ja DNA-analüüsis. 49. Nukleiinhapete hübridiseerimine In situ hübridisatsiooni (ISH) põhimõte on fikseeritud koetükis märgistatud nukleiinhappe (DNA või RNA) ahela kinnitamine komplementaarse DNA või RNA ahela külge. Seda tehakse kuumutamisega, millele järgnevalt tuvastatakse vaatlusega uuritava sondi ehk märgistatud ahela asukoht. Seda meetodit saab kasutada selleks, et
Milleks kasutatakse bioloogias tsentrifuugimist? Kasutatakse väikeste koguste bioloogiliste molekulide eraldamiseks ja koostise uurimiseks. Tsentrifugaaljõudu kasutatakse bioloogiliste osakeste koostise uurimiseks. Selle abil saab eraldada nt. ribosoome, proteiine ja viirusi, samuti uurida rakumembraani kihte. Saab nt. kindlaks teha missugustest aminohapetest koosneb valk jne. Molekulid kas lahustuvad tsentrifuugi käigus, vajuvad põhja või moodustuvad kihid. Geel-elektroforees on elektroforeesi rakendus, mida kasutatakse erinevate elektriliselt laetud molekulide (DNA, RNA, valgud) eraldamiseks pikkuse, laengu või konformatsiooni järgi agaroosist. Negatiivselt laetud nukleiinhapete (DNA, RNA) molekulid liiguvad agaroosgeelis elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile, agroosis peatuvad pikemad molekulid lähemal alguskohale (hambale). Lisaks molekulide erinevale suurusele mõjutab nende liikumist ka konformatsioon – tsirkulaarsed molekulid liiguvad kas aeglasemalt või
1. Suhkrute lühiiseloomustus. (CH2On) e süsivesikud on org.ühendid : koostis süsinik, vesinik, hapnik. Lihtsuhkrud monosahhariidid. Liitsuhkrud *oligosahhariidid (2-10 kovalentselt seotud monosahhariidi jääki); *polüsahhariidid (sadu kuni tuhandeid monosahhariidi jääke). Monosahhariidid jagunevad: *C-aatomite arvu järgi (trioos, tetroos); *funk.ühma järgi (aldoosid, ketoonid); *tsüklilise struktuuri alusel (püranoosid, furanoosid). Polüsahhariidid: *homopolüsahhariidid (ühe monosahhariidi jäägid); *heteropolüsahhariidid (mitme monosahhariidi jäägid); *hargnenud või lineaarse ahelaga. Bioloogiline roll: *väga mitmekesine ja looduses laialt levinud org.molekulide klass; *päikese energia salvestatakse fotosünteetiliste organismide poolt süsivesikutesse; *paljude biomolekulide eelühendid; ...
esindatud nii positiivselt kui negatiivselt laetud rühmad, eksisteerib ka pH väärtus, mille juures molekulide keskmine laeng on null ehk molekulil esineb isoelektriline punkt. Kui molekulis domineerivad happelised rühmad on pI madal, kui aga domineerivad aluselised rühmad on pI kõrge. Konkreetse valgu pI väärtus on seda valku iseloomustavaks suuruseks. Amfolüütide ja polüamfolüütide pI on võimalik määrata eksperimentaalselt. Selleks kasutatakse elektroforeesi pH gradiendis ja seda nimetatakse isoelektriliseks fokuseerimiseks. Elektrivälja toimel amfolüütide lahusele hakkavad summaarset positiivset laengut kandvad molekulid liikuma katoodile (katioonid liiguvad katoodile) ja negatiivset kogulaengut kandvad molekulid liiguvad anoodi suunas (anioonid liiguvad anoodile). Isoelektrilises punktis on molekulide keskmine laeng null ja seetõttu nad elektriväljas ei liigu. Kuna elektroforees viiakse
Geenitehnoloogia eksam 1. Suhkrute lühiiseloomustus. Süsivesikud=sahhariidid. On orgaanilised ühendid, mille koostises esinevad süsinik, vesinik ja hapnik. Süsivesikud säilitavad rakusiseselt keemilist energiat. Rakk saab energiat suhkrumolekulide lagunemisel lihtsateks ühenditeks, aeroobidel veeks ja süsihappegaasiks. I Monosahhariidid ehk lihtsuhkrud on madalamolekulaarsed ühendid, milles süsinike arv on enamasti kolmest kuueni- riboos ja desoküriboos (5 süsinikulised). Glükoos ehk viinamarjasuhkur- kiire energiaallikas, näitab veresuhkrutaset. Funktsioon- energeetiline, DNAs ja RNAs ehituslik (6 süsinikuline). Rohelistes taimedes moodustub glükoos fotosünteesi tulemusena, loomorganismid saavad seda toidust. Fruktoos ehk puuviljasuhkur. II Polüsahhariidid on kõrgmolekulaarsed orgaanilised ühendid (polümeerid), mille ehituslikeks lülideks (monomeerideks) on mono...
KORDAMISKÜSIMUSED Talpsep 1. Millisel juhul on LCR eelistatud meetod PCR ga võrreldes LCR on suurema spetsiifilisusega kui PCR. Seda on kaval kasutada tuntud järjestuste ja punktmutatsioonide tuvastamiseks kui kasutada oleva DNA kogus on limiteeritud. 2. Milline meetod võimaldab RNA amplifitseerimist DNA juuresolekul? NASBA on RNA tuvastamiseks eriti hea meetod: RNA ahelale saab panna pöördtranskriptaasiga praimeri juurde, sünteesitakse uus ahel, RNAas lõhutakse H-ga ära ja sünteesitakse uuesti jne kuni saadakse detekteeritav kogus nukleiinhappe molekule. Tal on ka see omadus, et töötab DNA juuresolekul ei pea proovi ära puhastama, mis RNA puhul on väga keeruline. Kasutatakse ka ekspressiooniproduktide määramiseks. 3. Millised ensüümid on vajalikud TMA meetodil amplifitseerimiseks? TMA- transcription mediated amplification. RNA polümeraas ja pöördtranskriptaas ...
H3 – raskete ahelate variaablid. Loopid. Seondumine ei ole kovalentne aga on väga tugev. Vereseerumis on kõige rohkem albumiini valku, kuidas lahutada valgud? Lahutamine sõötub nende isoelektrilisest täpst. Albumiini isoelektriline täpp on happelises piirkonnas. Isoelektrriline täpp – pH väärtus kui tema laeng on null. Albumiiin liigub kiirelt siis. Grupp valke mis liigub vähe, isoelektriline punkt pH 8. Gamma globuliini mõiste on seotud elektroforeesi tehnikaga. Inimese viis erinevat klassi antikehasid, eri tüüpi raske ahel. IgM tüüpi antikegadel (ja IgA tüüpi) on peale raskete ja kergete ahelte veel J-segment valk (ahel)?? esimene antikeha mida sekreteeritakse on IgM, kui patogeen ründab. Saa kindlaks teha nt kui millal borrelioos ründas, IgM tekib algul ja mõne nädala jooksul langeb ja toimub ümberlülitumine IgG tüüp antikehadele. IgE tüüpi seotud ülitundlikkusreakstioonidega
Elektroforees (elektro + kr phoros kandev) on elektriliselt laetud osakeste liikumine vedelikus elektrivälja mõjul: positiivsed osakesed katoodile ja negatiivsed osakesed anoodile. Seda omadust, et erisuguse suuruse ja laenguga osakesed liiguvad elektroodide vahel erineva kiiruse ja suunaga, rakendatakse aineosakeste üksteisest eraldamiseks vastavalt nende laengule või suurusele, ka sõltuvalt molekulide pikkusest. Elektroforeesi kasutatakse nt valkude ja DNA -analüüsis, elektroonilise paberi tehnikas, samuti metalli pinnale kolloidosakestest kattekihi tekitamiseks 11. Nukleotiidid Nukleotiidid on nukleiinhappe monomeerid. Nad on nukleosiidide mono-, di- või trifosfaatestrid. Riboosi/desoksüriboosi esterifitseerumine fosforhappejäägiga annab ribonukleotiidi/desoksüribonukleotiidi. Mononukleotiidid võivad olla mono-, di- või trifosforüülitud. DNA-s võivad esineda nukleotiidid:
ja afiinsuskromatograafia) põhimõte. Ioonvahetuskromatograafia – positiivselt laetud kerakestele seostuvad negatiivselt laetud molekulid. Positiivselt laetud molekulid ei seostu ja tulevad kolonnist läbi. Geelfiltratsioonkromatograafia – väiksed molekulid takerduvad poorsetesse kerakestesse, suured läbivad kolonni vabalt. Afiinsuskromatograafia – keraksetega kovalentselt seotud molekulidele seostuvad neile spetsiifilised molekulid. SDS-polüakrüülamiidgeel elektroforeesi tööpõhimõte. Proov geelile, valgud liiguvad + poole, saab hinnata valkude suurust Valkude ülekanne SDS-polüakrüülamiidgeelilt membraanile ning nende tuvastamine antikehade abil. Geelilt kantakse membraanile, inkubeeritakse antikehadega, loputatakse, inkubeeritakse ensüümiga, loputatakse, kromogenne dekteteerimine Kahedimensionaalse geelelektroforeesi põhimõte. Proteiini segu isoelektriline fokuseerimine, esimene geel teise peale ja SDS elektroforees Erinevad koetüübid.
Analüütide määramiseks kasuta- Kasutatakse mitmesuguseid Kasutatakse matemaatilise statis- takse spetsiifilisi keemilisi aparaate ja instrumente. tika meetodeid, et kavandada reagente ja testreaktsioone ning Enimkasutatavad on kromato- optimaalseid eksperimendi prot- meetodeid nagu mahtanalüüs graafia meetodid, spektraalmee- seduure ja ekstraheerida mõõt- (tiitrimine) ja kaalanalüüs. Kasuta- todid, elektroforeesi meetodid jt. mistulemustest maksimaalset takse ka füüsikalis-keemiliste Kaasaegses analüütilises keemias infot proovi koostise kohta. karakteristikute (sulamistempera- domineerivad just tundlikul tuuri, keemistemperatuuri, tihe- aparatuuril põhinevad meetodid, duse, murdumisnäitaja) määra- sealhulgas kombineeritud misandmeid. (hübriid-) tehnikad. Komplitseeri-
Rakuteooria ametlikuks sünniajaks loetaks aastaid 1838-1839. Šoti botaanik Robert Brown (1773–1858) oli esimene, kes vaatles orhidee lehti ja kirjeldas rakutuuma kui rakkude olulist komponenti (1831). 1838.a. ütles botaanik Matthias Jakob Schleiden (1804-1881) välja, et taime kõik osad koosnevad rakkudest või nende produktidest. Järgmisel aastal tehti samasugune järeldus ka loomorganismide kohta Theodor Schwanni (1810-1882) poolt. Schleideni ja Schwanni järeldused loetaksegi rakuteooria formuleeringuks. Kolmas mees, kelle nime rakuteooria loomise juures samuti mainitakse, on Rudolf Virchow (1821-1902). Tema väitis, et "niisamuti kui loomad tekivad vaid loomadest ja taimed taimedest, peab ka raku tekkimiseks olema temale eelnev rakk". Ehk lühidalt: rakk tekib rakust (omnis cellula e cellula). See teooria rõhutas elusorganismide ühtsust ning tõi esile kontseptsiooni elusorganismidest kui rakkude kooslustest. Koos evolutsiooniteooriga on r...
1. TOIT JA SELLE TÄHTSUS Iga toiduaine, mis turule jõuab, peab olema tarbijale ohutu ning vastama kvaliteedi- nõuetele. Selle tagamiseks on välja antud vastavad õigusaktid. Nõuded, millele turustamisotstarbeline toidutoore ja toit peavad vastama, on järgmised. 1. Toit peab olema ohutu inimese tervisele. 2. Toidus ei tohi olla selle omadusi halvendavaid või inimese tervist ohustavaid parasiite, kahjureid ega võõrkehi. 3. Keelatud on käidelda riknenud, saastunud või mikrobioloogilistele nõuetele mittevastavat toidutooret ja toitu. 4. Toit peab vastama seda iseloomustavatele koostis- ja kvaliteedinõuetele. 5. Loomsele toidule esitatavad erinõuded: 1) värskena müüdav või muul viisil üle antav liha peab olema veterinaarkontrolli tulemusel tunnistatud toidukõlblikuks, mida tõendatakse veterinaartõendiga; 2) loomset toidutooret ja toitu on keelatud kasutada, kui loomale on manustatud ravimit, ravimitaolist võ...
sisse, puudub kontsentratsioonigradient ning difusiooni ei esine. Uuritava kontsentratsiooniga komponent asetatakse geeli süvenditesse, uuritav komponent hakkab difundeeruma kontsentratsiooni vähenemise suunas. Seos kontsentratsiooni languse ja difundeerumisraadiuse vahel on logaritmiline, kusjuures ka mõõtmisviga võimendub logaritmiliselt. Kolmandaks immuundifusiooni meetodi võimaluseks on selle kombineerimine elektroforeesiga. Selle juures eristatakse immuno-, rakett- ja vastuvoolu elektroforeesi. Immuundifusioonimeetodite analüütiline tundlikkus on tagasihoidlik, vajab mõlemat reaktsioonipoolt küllaltki suures koguses. Antigeenide määramine veres ja kudedes: Turbido- ja nefelomeetrias mõõdetakse immuunreaktsioon valguse hajumise fenomeni kaudu. Nefelomeetrias lahuse hägususe suurenedes valgusvoog detektorisse suureneb. Turbidomeetrias lahuse hägususe suurenedes valgusvoog detektorisse väheneb. Neid meetodeid kasutatakse
annaabi.ee 
Sisene Facebook'ga
Sisene Google'ga
Sisene LinkedIn'ga
