Molekulaarbioloogia 2. töö küsimused (0)

Kromosoom joonistada, struktuurielemendid.
Geen – Nukleiinhappe järjestus, mis on vajalik funktsionaalse geeniprodukti (valk või RNA) sünteesiks. Sisaldab lisaks kodeerivatele eksonitele ka mittekodeerivaid introne, ja kontrollregioone.
Geenistruktuur – vaja teada, joonistada.
Promootor – Startsaidi lähedal asuv kontrollala (DNA regioon), mis reguleerib kogu operoni transkriptsiooni. Promootorites on spets DNA järjestus ja response elemendid, mis võimaldavad sidumissaidi RNA polümeraasile ja transkriptsioonifaktoritele.
Transkriptsioonifaktor – Järjestuse spetsiifiline DNAd siduv faktor. Valk, mis seonduv kindla DNA piirkonnaga. Osa süsteemist, mis kontrollib transkriptsiooni (DNA->RNA süntees). Teeb seda üksi või koos teiste valkkompleksidega, kas suurendades (kui aktivaator ) või ära hoides (kui repressor ) RNA polümeraaasi seondumist.
Mobiilne DNA – DNA, mis liigub iseeneslikult genoomis ringi. Võivad põhjustada mutatsioone , liikudes genoomi uutesse lookustesse ja muudavad DNA hulka genoomis. Kasulikud uurijatele, et muuta DNA’d elusorganismis. Elemendid – transposoonid , retrotransposoonid, DNA tr., plasmiidid , bakteriofaagi elemendid.
Kromatiin – Nukleiinhappe valkkompleks, nähtav interfaasis kui rakud ei jagune. Rakufaasis on jaotunud ühtlaselt üle kogu tuuma. Struktuur sarnane kõigil eukarüootidel. Kromatiin pakkimise käigus moodustab mitoosi ajal ( metafaasis ) nähtavaid kromosoome.
Mediaatori funktsioon transkriptsiooni initsiatsioonil
Mediaator on suur valkkompleks, mis funktsioneerib transkriptsiooni koaktivaatorina.
Pol II initsiatsiooniks in vivo on vaja multivalkset mediaator-kompleksi, mis assotsieeruks mittefosforüülitud Polümeraas II C-terminusega, moodustades väga suure holoensüümi ning sisaldades ka enamuse generaalsetest transkriptsiooni faktoritest, toimides sillana ensüümi ja transkriptsioonifaktorite vahel. Ehk – mediaator mõjutab otseselt transkriptsiooni preinitsiatsiooni kompleksi kokkupanekut.
(Mediaatorkonpleks on vajalik edukaks transkriptsiooniks peaaegu kõikides II klassi geeni promootorites pärmis)
Mida reguleerib nonsense mediated decay pathway?
NMD on rakumehhanism mRNA jälgimiseks, et tuvastada nonsense mutatsioone ja ära hoida vigaste valkude ekspressiooni. Imetajates vallandab NMD exon-junction kompleks ( ekson - intron liides) (EJC), mis on algselt hoiustatud pre-mRNA splicingu ajal. Tavaliselt EJC eemaldatakse ribosoomi abil esimeses mRNA translatsiooni ringis .
Samas – kui EJC leidub allavoolu nonsense koodonit, siis EJC on ikka mRNA küljes kui ribosoom jõuab nonsense koodonini, seega ta võib toimida NMD vallapäästjana.
Allavoolu EJC olemasolu tuvastatakse kui probleem NMD faktorite poolt ja RNA degradeeritakse. NMD toimub tsütoplasmas.
nonsense mediated decay – ühe või enam eksoni vahele jätmine, mis põhjustab ekson-intron liidese vahetus 3’ läheduses Stop koodoni sissetuleku. Kõigi korrektselt splaisitud mRNAde puhul Stop koodon on viimases eksonis. Nonsense mediated decay vahendab kiiret mRNAde lagundamist, kus Stop koodonid esinevad mRNAs enne viimast splaisiliidest.
Arvatakse,et Stop koodoni sissesplaisimise korral ekson-intron liidese kompleksid RNA-lt lahti ei tule ning seda ribosoomset skanneerimist ei alustata.
Capping protsess
5' cap on spetsiaalne mRNA 5' lõpu otsa pandud nukleotiidne lõpp. Protsess on oluline, et luua küpset mRNA, mis saab astuda translatsiooni. Cappimine kindlustab mRNA stabiilsuse translatsiooni ajal (valgusünteesi protsessi ajal). See on väga reguleeritud protsess, mis toimub rakutuumas ja vaid funktsionaalne mRNA transporditakse tsütoplasmasse. Cap on guanosiinnukleotiid, mis on seotud mRNA külge 5' 5' !!! trifosfaat sidemega.
Capping ensüüm seostub RNA polümeraas II fosforüülitud(3P) C-terminusega, capping ensüüm ei interakteeru polümeraas I ja III-ga ,sest neil pole C-terminust, seega capping on omane ainult mRNA'dele.
1)Üks 5' lõppfosfaatrühm lõigatakse fosfataasi poolt ära.
2) GTP lisatakse lõppfosfaadile guanolüül transferaasi poolt, kaotadest 2 fosfaatrühma GTP'lt protsessi käigus (tekib GMP). See viib 5' - 5' trifosfaat sidemele.
3) 7-N guaniinil metüleeritakse (metüültransferaasi poolt)
4) Teisi metüültransferaase kasutatakse valikuliselt lähedaste 5' nukleotiidide metüleerimisel. (RNA 5' otsas paiknevate ribooside 2' oksügeenidele)
Capi funktsioonid - 1) tuumaekspordi regulatsioon 2) kaitseb selle eest, et eksonukleaasid (otsast 5'-3' lõikavad) tulevad lõikama, aga see on 5'-5' 3) translatsiooni promootor 4)
5' lähimate intronite äralõikamise promootor
Mis on HDAC ehk histooni deatsetülaas
Ensüümiklass, mis eemaldab atsetüülgrupid epsilon-N-atsetüül lüsiin aminohappe histoonil. See teguviis on vastupidine histoon atsetüültransferaasile
HDAC eemaldab need atsetüülgrupid, et suurendada positiivset laengut histoonide sabades ja soodustab suure afiinsusega sidumist histoonide ja DNA selgroo vahel. See protsess kondenseerib DNA struktuuri, hoides ära transkriptsiooni.
HDAC tegeleb keskkonnast tuleneva info protsessimisega, rakuprotsessidega, raku kasvu ja surmaga, inimhaigustega ntx vähiga.
Deatsetüleerimine muudab kromatiini resistentseks nukleaasidele ja moodustub kromatiin kiudstruktuur (väga kokkupakitud)
Atsetüleeritud vormis DNA fosfaatrühma negatiivne laeng neutraliseerib lüsiini positiivset laengut. Atsetüleeritud vorm on see, mis on vähem pakitud – aktiveerib transkriptsiooni faktoreid (pääseb paremini ligi/ struktuur pärlikee)
Kirjelda eksperimenti, mille abil saab tuvastada transkriptsiooni faktorite sidumise aktiivsust promootorsaidil
1) DnaasI footprinting põhineb asjaolul, et kui valk istub DNA peal, siis ta kaitseb viimast eksonukleaaside aktiivsuse vastu. Kui DNA fragmendid ühest otsast radioaktiivselt märkida ning eksponeerida neid eksonukleaassele aktiivsusele, siis geeli autoradiogrammil on näha valgu olemasolul ja puudumisel erinevad DNA mustrid . DNA ja valgu kompleksi puhul esinevad DNA järjestusalas „augud“ (footprintid). Footprintinguga saab määrata ka järjestust, millele uuritav valk seob.
2) EMSA on kasulik meetod DNAd siduvate valkude kvantitatiivseks analüüsiks. Üldjuhul on DNA fragmentide elektroforeetiline mobiilsus langenud, kui nad on valguga kompleksis, mis põhjustab fragmendi geeli asukoha muutust (bänd (värv) jääb maha võrreldes vaba DNAga). Seda analüüsi saab kasutada tuvastamaks valgulüsaadist regulaatorvalgu olemasolu kasutades tuntud regulaatorelementi sisaldavat DNA fragmenti, mis on eelnevalt radioaktiivselt märgitud.
Lane 1 is a negative control, and contains only DNA. Lane 2 contains protein as well as a DNA fragment that, based on its sequence, does not interact. Rida 3 sisaldab valku ja DNA fragmenti, mis reageerib. Saadud kompleks on suure, raskem ja aeglasem. Muster real 3 on sellisel juhul kui kogu DNA oleks seotud ja elektroforeesi ajal ei toimunud üldse kompleksi dissotsieerumist. Kui need tingimused ei ole täidetud, siis võib seal olla ka teine band, (real 3), mis tähendaks vaba DNA olemasolu või DNA-valk kompleksi dissotsieerumist.
Valgule võib lisada ka veel antikeha , mistõttu moodustub veel suurem kompleks ja ta liigub veel vähem.