POx, antud töös rõika peroksüdaas (doonor:H 2O2-oksüdoreduktaas), on samuti liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. Viimane teeb sellest valgust hemo- ehk kromoproteiini. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina vesinikperoksiidi, mille redutseerumisel moodustub vesi. POx-i reaktsiooni saab jälgida spektrofotomeetriliselt, kui kasutada substraati, mile oksüdeerumisel tekib kromogeenne substraat (värviline produkt). Värvi intensiivsus on võrdeline uuritava proovi glükoosisisaldusega. Kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate nagu näiteks diaminobensidiin, tetrametüülbensidiin, samuti 2-tolidiin jt. Antud töös kasutatakse substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II) (K 4[Fe(CN)6]) ehk kollast veresoola. POx katalüüsib raud(II) raud(III)-ks ja vesinikperoksiid redutseerub veeks. Kaaliumheksatsüanoferraat(III) (K3[Fe(CN)6]) ehk punane veresool anna
Minu konkreetne tööülesanne oli glükoosisisalduse määramine sidrunimahlas, POx substraadina kasutasime kaaliumheksatsüanoferraati (II). Töö käik Tööreaktiiv Tööreaktiiv sisaldas 2,5 mg GOx, 1,5 mg POx, 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0 ning ülejäänud 0,1% kaaliumheksatsüanoferraati (II), et täita 25 ml mõõtekolb. Mina töötasin juba ettevalmistatud tööreaktiiviga. Uuritava lahuse ettevalmistamine Minu uuritavaks prooviks oli sidrunimahl. Pigistasin sidrunist välja väikese koguse mahla, juhendajalt sain juhised lahuse lahjendusmäära osas: tuli võtta 1ml sidrunimahla 25 ml lahuse jaoks. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks sidrunimahlas tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni (x telg) lahuse optilise tihedusega (y telg) lainepikkusel 410 nm.
Biokeemia praktikum Laboratoorne töö nr.3.3 Anna Logunova YAGB-22 103347 Glükoosi sisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Teooria Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks biologilistes objektides,nagu vereseerum,toiduained,taimne tooraine jm kasutatakse laildaselt ensümaatilist meetodilt,mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. Glükoosi oksüdaas katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel.Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja D-glükoonhappe. Peroksüdaas ktalüüsib spetsifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati,, mille redutseerumisel moodustub vesi. Pox-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate.Peroksüdaasi reaktsioonil võib
TTÜ keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool Biokeemia Laboratoorne töö Töö pealkiri: nr: 6 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Õpperühm: Töö teostaja: Õppejõud: Töö teostatud: Protokoll esitatud: Protokoll Terje Robal 18.04.2012 09.05.2012 arvestatud: Teooria Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse tihti ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. Meetod võimaldab määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul, sest GOx on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes. GOx kujutab endast liitvalku, mis sisaldab FAD-i. Ka POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist. Pox-i reaktsiooni on hõlbus jälgida spektrofotomeetriliselt, kui kasutada substraati, mill
1. Töö teoreetilised alused Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides (vereseerum, toiduained) kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümde glükoosi oksüdaasi ja peroksüdaasi kasutamisel. Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele ,D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel, reaktsiooniproduktideks vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. GOx on liitvalk, flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise osana flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D- glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Sell
komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimub koensüümina. Järgmises etappis kasutatakse peroksüdaaside esindajat, rõika peroksüdaasi (EC 1.11.1.7), mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. Kui kasutata substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine: Peroksüdaas Oksüdeeritud substraat + H2O2 Taandatud substraat + 2 H2O Värvusetu Värviline Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 reedutseerimine H2O-ks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6], ehk punane veresool annab lahusele kollase
oksüdeerumist (=dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O. Kasutades substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat) saab POx-i reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni skeem on järgmine: Peroksüdaas Taandatud substraat + H2O2 → Oksüdeeritud substraat + 2H2O Värvusetu Värviline peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(ll), K4[Fe(CN)6] ehk kollast veresoola. POx katalüüsib Fe 2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm
teljel peale reaktsiooni läbiviimist mõõdetud lahuse optiline tihedus ehk absorptsioon ( tähis D või ABS). Tööreaktiivi koostis: Tavaliselt valmistatakse tööreaktiivi 25 ml vastava mahuga mõõtkolvis ja see sisaldab: · 2,5 mg glükoosi oksüdaasi · 1,5 mg peroksüdaasi · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH= 6,0 · K-heksatsüanoferraat(II) K4(Fe(CN)6) 0,1%-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini. Uuritav proov (tundmatu lahus) Uuritavaks prooviks ehk tundmatuks lahuseks, milles tuleb glükoosi kontsentratsioon määrata, võib olla: · Glkoosi vesilahus · Mee lahus · Hele puuviljamahl (viinamarja, õuna vms) · Mõni füsioloogiline lahus (vereseerum, uriin jne). Minul oli uuritavaks prooviks viinamarja mahl, mille kontsentratsiooni ma pidin määrama. Tundmatu lahuse ettevalmistamine Mahl või mõni muu vedelik
· POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. · Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril. Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (mesi). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Töö reaktiivi koostis : (25 ml kolvis sisaldub) · 2,5 mg GOD · 1,5 mg POD · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0 · K3[Fe(CN)6] (K-heksatsüanoferraat(II)) 0,1% lahus, mis täidab kolvi märgini. Uuritava proovi (mee lahus) ettevalmistamine: 1. Kaalusin analüütilisel kaalul kaaluklaasi 0,11 g mett. 2. Viisin meeproovi kvantitatiivselt (kadudeta) 200 ml mõõtekolbi (et ei peaks rohkem lahjendama)
vesinikperoksiidi, mille redutseerumisel moodustub vesi. Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat), siis saab peroksüdaasi reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon (lahuse värvuse intensiivsus) on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni põhimõtteline skeem: Peroksüdaas Oksüdeeritud substraat + H2O2 Taandatud substraat + 2 H2O Värvusetu Värviline Peroksüdaasi toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate. O-tolidiini okspüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Peroksüdaasi reaktsioonil võib
· 2,5 mg glükoosi oksüdaas · 1,5 mg peroksüdaas · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhver, pH 6,0; · K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahus Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles glükoosi kontsentratsiooni tuleb kindlaks määrata, võib olla Glükoosi vesilahus Mee lahus Hele puuvlija mahl( viinamarja, õuna, sidruni, greibi vm) Mõni füsioloogiline lahus(vereseerum, uriin jne ) Minu uuritavaks prooviks oli sidrunimahl Tegin lahjenduse: 1 ml sidrunimahla ning lisasin destilleeritud vett 25 ml mõõtkolbi kriipsuni. Kui tundmatuks prooviks on naturaalne puuviljamahl või mõni füsioloogiline vedelik, siis igal konkreetsel juhul toimitakse uuriava lahuse ettevalmistamisel ja lahjendusmäära valikul praktikumi juhendaja soovituste järgi. Puuviljamahlade uurimisel lähtutakse reeglina puuviljadest ja pressitakse neist välja väike kogus (2-3 ml) mahla, mida siis vajalikul märral lahjendatakse.
Tallinna Tehnikaülikool Biokeemia Laboratoorne töö 3.3 Teostaja: 2016 3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides (vereseerum, toiduained jm) kasutatatkse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele ,D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx-i süstemaatiline nimetus ,D-glükoosi:O2-oksüdoreaduktaas (EC 1.1.3.4) näitab, et ta katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Produktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsides moodustab D- glükoonhappe. GOx kujutab endast liitvalku, täpsemalt flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponentina flav
oksüdeerumist kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O. NB Mida alltoodud reakts. skeem näitab Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt ,siis saab PO x-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Oksüdeeritud substraat + H 2 O 2 Peroksüdaas Taandatud substraat +2 H 2 O → Värvusetu Värviline Mis tegelikult toimub Kirjutage õige reakts. skeem. Lisaks nimetatud orgaanilistele ühenditele võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2
moodustuvad ekvimolaarses koguses). POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist. Värvilise produkti puhul saab POx- reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Seejuures on värvilise ühendi kontsentratsioon võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. See on tingitud lisatud ainete kogustest. Skeemil on substraadid valesti märgitud. Võrrandi vasakul pool peaks olema värvusetu taandatud substraat ehk kromogeenne substraat (kasutusel mitmed orgaanilised ühendid) ja paremal pool värviline oküdeeritud substraat. Antud töös on kromogeense substraadina kaasutusel kollane veresool K 4[Fe(CN)6]. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, tekib punane veresool K 3[Fe(CN)6]. Viimase kogus on võrdelises sõltuvuses oksüdeeritud glükoosi kogusega, sest GOx reaktsioonil saame ekvimolaarses koguses oksüdeeritud glükoosi ja vesinikperoksiidi
Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 ml destilleeritud vett, katseklaasidesse nr 2 ja 3 1 ml mee tõmmist ning katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust (mida olin eelnevalt valmistanud). Seejärel lisasin igasse katseklaasi 3 ml tööreaktiivi, loksutasin ning hoidsin katseklaase 20 minutit toatemperatuuril. Kaliibrismisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine Proov Optiline tihedus Optiline tihedus kontrollproovita Destilleeritud vesi 0,0832 - (kontrollproov) Mee tõmmis 1 0,1714 0,0882 Mee tõmmis 2 0,1710 0,0878 Glükoosilahuse lahjendus I 0,2298 0,1466
Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik Töötatakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: · 2,5 mg glükoosi oksüdaas · 1,5 mg peroksüdaas · 16,6 ml 0,2M fosfaatpuhver, pH=6,0; · K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahus Tundmatu lahuse ettevalmistamine Uuritav proov on melonilahus. Etteantud melonotüki riivisin ära, selle käigus sain vajaliku hulga mahla, millest kasutasin 1 ml. Saadud mahla lahjendasin destilleeritud veega 50ml mahuni, seega teostasin 50 kordse lahjenduse. Glükoosilahuste valmistamine kaliirimisgraafiku koostamiseks Kindla glükoosi kontsentratsiooniga lahuste valmistamiseks lähtusin glükoosi standardlahusest, milles glükoosi kontsentratsioon on täpselt 1,0 mg/ml. 1
GOD sisaldab flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensümm. FAD kaasabil kantakse glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit hapnikule, mille tulemusena oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja tekib viimasega ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. Reaktsiooni järgmises etapis osaleb POD, mis sisaldab prosteetilise rühmana heemi. POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). Teine substraat H2O2 toimib seejuures kui vesiniku aktseptor, redutseerudes H2O-ks. Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses glükoosisisalduses uuritavas proovis. Reaktsiooni põhimõttleine skeem: POD toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina võib kasutada väga erinevaid keemilisi ühendeid. Üheks võimalikuks substraadiks on o-
3.3.Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Kaisa Rahuoja 093421 KATB41 3.3. Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Katse käik: 1. Uuritava lahuse ettevalmistamine : prooviks, milles hakatakse glükoosisisaldust määrama, on sidrunimahl. Proovi saamiseks pressisin kõigepealt sidrunist välja väikese koguse mahla (1-2 ml) ning tegin sellest praktikumi juhendaja soovituste kohaselt 50-kordse lahjenduse. Selleks pipeteerisin 0,5 ml sidrunimahla automaatpipetiga 25ml mõõtkolbi ning täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega. 2. Glükoosilahuse valmistamine kalibreerimisgraafiku koostamiseks: Glükoosilahused valmistan glükoosi standardlahuse lahjendamise teel proovide järjestikkusel lahjendamisel
oksüdoreduktaas.) POx on hemoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina H2O2 (moodustub H2O). Kui substraati oksüdeerimisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat), siis saab POx reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon sõltub glükoosisisaldusest. Oksüdeeritud substrat + H2O2 taandatud substraat + H2O värvitu värviline Oksüdeeruva kromogeense substraadinan kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate. Meie juhul aga kasutame kaaliumheksatsüaanoferraati(II), K4{Fe(CN)6}. (kollane veresool). 2 Fe2+ + H2O2 + 2H+ 2Fe3+ + 2H2O kollane veresool punane veresool Punane veresool annab lahusele kollase värvuse. Detekteeritav lainepikkus 410 nm. Sobiv keskkonna pH on 6. Töö käik.
POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril. Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (greibimahl). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Uuritava proovi (greibimahla lahjendus) ettevalmistamine: Valmistasin greibimahlast 1:100 lahjenduse. Selleks pipeteerisin automaatpipetiga 0,5 ml pigistatud greibi mahla 50 ml kolbi, täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega ning loksutasin segamini. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks: Valmistasin 1,0 mg/ml kontsentrasiooniga glükoosi lahusest 3 lahjendust: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml
GOD kasutamine annab võimalust määrata glükoosi ka teiste suhkrute juuresolekul. GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. See ensüüm sisaldab flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mille abil glükoosi molekulilt kantakse kaks vesiniku aatomit hapnikule. Tulemusena toimub glükoosi oksüdeerumine glükoonhappeks ja tekib vesinikperoksiid. Järgmises etappis osaleb POD. See katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist. Teine substraat H2O2 redutseerub, andes vett. Kasutades substraati, mis oksüdeerub andes värvilist produkti, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Lahuse värvuse intensiivsus on võrdelises sõltuvuses glükoosisisaldusest uuritavas proovis. Värvilise substraadina kasutatakse kaaliumheksatsüaanoferraati(II), nn kollane veresool. Reaktsiooni käigus Fe2+ oksüdeerub Fe3+-ks, sellega kaasneb H2O2 redutseerumine. Tekib punane veresool, mis
,D-glükoos O D-glükonolaktoon OH (HOCH) 4 + H2O 2 HO D-glükoonhape Reaktsiooni järgmises etapis osaleb POx, mis sisaldab prosteetilise rühmana heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). Teine substraat H2O2 toimib seejuures kui vesiniku aktseptor, redutseerudes H2O -ks. Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses glükoosisisalduses uuritavas proovis. Reaktsiooni põhimõtteline skeem: peroksüdaas Oksüdeeritud substraat värvusetu
FAD seab glükoosi molekuli kaks vesiniku aatomit, redutseerib FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldab lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside esindajat, mille nimetus on doonor: H 202- oksüdoreduktaas. Kui kasutatakse substraadi, mille oksüdeerimisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektofotomeetriliselt. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine: Taandatud substraat + H2O2 Oksüdeeritud substaat + 2 H2O POx-i toimel oksüdeeruva kromgeense substraadina kasutatakse bensidiini derivaate. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat (III), K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusele 410 nm. Reaktsioon kulgeb PO x-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. 2 Fe2+ +H2O2 + 2H+ 2 Fe 3+ +2 H2O Töö käik Tööreaktiiv
TTÜ Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool Töö nr. 3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. GOx-i on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes ning see võimaldab määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. ,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas katalüüsib ,Dglükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Produktideks on vesinikperoksiid ja ,Dglükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. GOx on liit- ehk konjugeeritud valk, flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk.FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub l
GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL Kasutatavad ained 3 viinamarja mahl, tööreaktiiv: Glükoosi oksüdaas(GOD), peroksüdaas(POD), K4[Fe(CN)6] 0,1 % vesilahus, 0,1 M Fosfaatpuhvrit ph 6. Kemism Glükoosi lahusele lisati tööreaktiivi, kus sisalduv GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GODis sisalduv flaviinadeniindinukleotiid abil oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja vesinikperoksiidiks. Edasi katalüüsib POD kromogeense substraadi kollase veresoola oksüdeerumist. PODi toimel oksüdeerub kollases vere soolas sisalduv Fe+2 Fe+3ks., millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv punane veresool annab lahusele hele kollaka värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Töökäik Kolmest etteantud viinamarjast uhmerdati välja 1ml klaari mahla. Saadud mahl lahjendati destileeritud veega 250 mlni. Õppejõult saadud glükoosi lahusest tehti kolm 4 kordset lahjendust. Esimesse katsekl
glükoonhappe. Järgmises etapis kasutatakse POx-i mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist kasutades elektronide akseptorina teist substraati, H 2O2, mille oksüdeerumisel moodustub H2O. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiin derivaate, mis on detekteeritavad vastavatel lainepikkustel. Töö käik · Õppejõult saadi prooviks sidrunimahl · Sidrunimahlast tehti 20x lahjendus ja filtriti · Valmistati 1mg/ml glükoosilahsest kaliibrimislahus glükoosi sisaldusega 0,25mg/ml ning sellest kaks lahjendust konsentratsioonidega 0,125mg/ml ja 0,062mg/ml · Seati valmis ja nummerdati 6 puhast katseklaasi · Katseklaasi o Nr 1 pipeteeriti 1ml destileeritud vett o Nr 2 ja 3 pipeteeriti 1ml uuritavat lahust
3.3.1.2 Rõika peroksüdaas Süstemaatiline nimetus: doonor: H2O2- Funktsioon: katalüüsib spetsiifiliste oksüdoreduktaas (EC 1.11.1.7) substraatide (e--doonorite) oksüdeerumist (=dehüdreerumist), kasutades e---de akseptorina H2O2, mille redutseerumisel moodustub vesi. Reaktsiooniproduktid: Struktuur: KROMOGEENNE SUBSTRAAT - Liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise substraat, mille oksüdeerumisel tekib komponendina heemi (hemo- ehk värviline produkt, mida saab kasutada POx-i kromoproteiin) reaktsooni jälgimiseks fotomeetriliselt · Värvilise ühendi kontsentratsioon (lahuse värvuse intensiivsus) on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.
...... 21 1.2.6 Selivanoff'i reaktsioon ................................................................................ 22 1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga ........................................................................ 23 Kontrollküsimused ............................................................................................... 23 1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID.............................................................................. 25 1.3.1 Rasvapleki proov ....................................................................................... 27 1.3.2. Emulsioonitest ........................................................................................... 28 1.3.3 Akroleiiniproov ........................................................................................... 28 1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides ......................................... 29 1.3
(elektronide doonorite) oksüdeerumist (= dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O. Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine: Peroksüdaas Taandatud substraat + H2O2 Oksüdeeritud substraat + 2 H2O Värvusetu Värviline Peroksüdaas 2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis. Tööreaktiiv: Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv,
Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab ensüüme POx ja GOx, kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötasin ettevalmistatud tööreaktiiviga. Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles tuli määrata glükoosi kontsentratsioon, oli minu katse puhul sidrunimahl. Sidrunimahlast tuli valmistada 25-kordne lahjendus. Selleks pipeteerisin gradueeritud katseklaasi 1 mL sidrunimahla ja ülejäänud 24 mL täitsin destilleeritud veega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi standardlahus sisaldab 1,0 mg/mL glükoosi. Standardlahusest valmistasin 3 lahjendust kontsentratsioonidega 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL ja 0,062 mg/mL. Lahjendamisel lähtsuin põhimõttest, et lahjendamiseks võetud standardlahuse mahus ja
moodustub polaarne tsenter. Amfifiilsuse tõttu saavad glütserofosfolipiidid moodustada vesikeskkonnas struktuure. Steroolide ehituslik alus on steraanituum ja nad on võimelised moodustama rasvhapetega estreid. Enam levinud loomne sterool on kolesterool, mida leidub paljudes loomsetes rakumembraanides ja mis tagab membraanide läbitavuse. Kolesteroolist toodetakse ka steroidhormoone, sapphappeid ja D-vitamiini. 1.3.1 Rasvapleki proov Kõike lipiide iseloomustab see, et nad on lahustuvad orgaanilistes lahustites. Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti ausutumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk, millest paberi läbipaistvus suureneb. Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates muust paberist tumedam. Töö käik · Võtsin 2 kuiva katseklaasi, millesse panin ~ 1 g (kummassegi erinevat) tahket ainet.
ühendid, seega valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid. 6. Kirjeldage ksantoproteiini- ja Milloni reaktsiooni kemismi. ksantoproteiini : Konts.lämmastikhappe lisamisel denatureerib valk pöördumatult ja sadestub. Katseklaasi sisu soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Moodustunud nitrofenooli tüüpi ühend on intensiivselt kollase värvusega ja käitub hape/alus indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranzi värvuse. Milloni reaktsioon: Milloni reaktiiv -elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid. Kuna türosiin esineb enamiku valkude koostises, siis suurem osa valkudest annab positiivse Milloni reaktsiooni, mille puhul valgu lahus või denatureerunud valgu sade värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)- punaseks.
pikast, konjugeeritud kaksidsidemeid sisaldavast süsivesinikahelast. Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab iseloomustada neeldumisspektri järgi. Neeldumisspekter on optilise tiheduse sõltuvus uuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest. Puhtal -karoteenil on apolaarsetes lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri sinises piirkonnas 425, 450 ja 480 nm juures. Kuna aga proov sisaldab üheaegselt erinevaid karotenoide, võib neeldumisspekter muutuda ja neeldumismaksimumid võivad paikneda hoopis teistel lainepikkustel. Kui proovis sisaldub samal ajal ka klorofüll, on täheldatavad neeldumismaksimumid lainepikkuste 470 ja 630 nm juures. Töö käik Karotenoidide isoleerimine taimses materjalist · Peenestatud paprikast mõõdetakse tehnilisel kaalul kaaluklaasis 0,5 g proovi. · Proov eelpeenestatakse noa abil.