Karotenoidide ja lipiidide protokoll (5)

Tallinna Tehnikaülikool
Biokeemia praktikum
2.5 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
29.04.09
Maria Simmul
082619
YAGB -21
Tallinn 2009
Karotenoidid on fotosünteesi abipigmendid taimedes, mis on kas kollased või punased. Karotenoidid on loomsetes organismides vitamiin A provitamiiniks ehk eelühendiks. Karoteeni alba , beeta ja gamma isomeeridest omab suurimat tähtsust beeta- karoteen , mis on punakasoranži värvusega isoprenoidne ühend, mille molekul loomorganismis poolestub, andes kaks retinooli, ehk vitamiin A molekuli.
Beeta-karoteen on kristalliline aine, mille sulamistemperatuur on 183-184 kraadi ja vees ta ei lahustu. Etanoolis lahustub karoteen piiratud ülatuses, kuid apolaarsetes orgaanilistes lahutsites lahustub hästi. Kuna beeta-karoteeni molekul, nagu teisedki karotenoidid, sisaldab hulgaliselt konjugeetirud kaksiksidemeid , siis neelab ta intensiivselt valgust spektri nähtavas osas. Seetõttu iseloomustema karoteeni sisaldust uuritavas materjalis neeldumisspektri järgi.
Antud töö eesmärgiks on taimsetest materjalidest eraldatud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle aluses uuritava materjali karotenoidse koostise iseloomustamine.
Töö käik:

Uuritavaks taimseks materjaliks oli porgand , mille riivisin ning kaalusin tehnilisel kaalul , kaalutiseks 1,34 g.

Lõplikuks peenestamiseks hõõrusin porgandit uhmris vähese pestud liivaga kuni ühtlase massi saavutamiseni.

Seejärel lisasin sinna ükskikute portsjonite kaupa veevaba naatriumsulfaati, mille kogus tuli umbes 5-10 kordne kaalutise suhtes. Hõõrusin kuni saavutasin ühtlase kuiva pulbri.

Järgnes karotenoidide ekstraktsioon sobiva orgaanilise lahustiga, milleks kasutasin petrooleetrit, tihetusega 0,78. Ekstrakti valasin klaaslehtri ja filterpaberiga varustatud mensuuri. Ekstraheerisin korduvalt, kuna uurisime karotenoide kvantitatiivselt. Ekstraheerimise lõpetasin, kuni ekstrakt oli värvitu.

Ekstrakti mõõtsin ära mensuuris, ja mahuks sain 11ml.

Järgmiseks võtsin ekstrakti neeldumisspektri spektrofotomeetris, võrdluslahusena kasutasin puhast petrooleetrit.
Lainepikkuseks 400-600nm.
Spektrite lainepikkused ja optilised tihetused:
477nm optiline tihedus: 1,182
449nm optiline tihedus: 1,334
426nm optiline tihedus: 1,004
Arvutamise valemis kasutan tihedust 1,334, sest sellele vastav lainepikkus(449) on kõige lähemal 452-le, vastav E= 2560 1%/1cm
Kirjanduse alusel leidsin beeta-karoteeni neeldumisspektrid: 425, 451, 482
alfa karoteeni: 420, 445, 475.
Sellest järeldan, et domineerivaks olid beeta-karotenoidid.
Beeta-karoteeni sisalduse uuritavas proovis arvutan vastavalt valemile:
K= D x V x d x 1000/E x g
Kus, D- ekstrakti optiline tihedus
E- 1% beeta-karoteeni lahuse ekstinktsioon lainepikkusel 450nm
V- ekstrakti kogumaht
d- ekstrahendi tihedus
g- uuritava proovi mass
1000- tegur üleminekuks milligrammidele
K= 1, 334 x 11 x 0,78 x 1000/ 2560 x 1, 34g = 3,336 mg%
Kokkuvõte:
Karoteenid on fotosünteesis täiendavateks kiirguse retseptoriteks, ja nende värvus varieerub kollasest punaseni. Lahustuvad hästi apolaarsetes orgaanilistes lahustites , näiteks heksaanis hepaanis.
Antud töös kasutatud porgandi analüüsist näen, et selles taimses materjalis domineerivad siiski beeta-karotenoidid, kuid lainepikkuste sarnasusi võib näha ka alfa-karoteeniga.
Tallinna Tehnikaülikool
Biokeemia praktikum
1.3 Lipiidide reaktsioonid
29.04.09
Maria Simmul
082619
YAGB-21
Tallinn 2009
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, kuhu kuuluvad ained on oma keemiliselt ehituselt enamasti estrid. Reeglina lipiidid vees ei lahustu, kuid lahustuvad orgaanilistes solventides, teistes lipiidides ning leelismetallide soolade lahustes. Lipiidide omadus mitte vees lahustuda põhineb hüdrofoobsete aatomirühmade ja radikaalide sisaldusest. Lipiidid kuuluvad rakumembraanide koostisesse, on loomsetes organismides energeetiliseks varuaineks ning täidavad mitmesuguseid kaitse-ja regulatoorseid funktsioone.
Antud töös tegime 3 katset:
Rasvapleki proov
Uurisime kahte tahket materjali, millest üks sisaldas lipiide .
Töö käik:
Kahte katseklaasi panin umbes 1g kummastki tahke aine proovist. Mõlemasse valasin umbes 1ml orgaanilist lahustit, milleks kasutasin etanooli ja lasin 5 min seista. Mõlemast katseklaasist kandsin tilga paberile ja kuivatasin. Vaatasin paberit vastu valgust ning õrnalt oli näha, et paberil , milles oli olnud proov nr 2 oli õrn plekk . See täheldas lipiidide olemasolu antud proovis. Arvatavasti panin etanooli liiga palju, muidu oleksid plekid selgemini näha olnud.
Akroleiinproov
Glütserooli kuumutamisel, eriti vett siduvate ainete juuresolekul, tekib terava lõhnaga küllastamata aldehüüd nimega propenaal, ehk siis akroleiin. Seega võimaldab akroleiini moodustumine otsustada, kas tegemist on glütserooli sisaldava või mittesisaldava lipiidiga
Töö käik:
Kuiva katseklaasi kantsin 1g NaHSO4 ja lisasin mõne tilga oliivõli. Kuumutasin segu põletil tõmbekapis soola sulamise ja reaktsioonisegu tumenemiseni. Tekkis ebameeldiv lõhn, mis meenutas veidi kõrbelõhna, see täheldas, et proov sisaldas lipiide.
Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse analoogiliselt süsivesinike uurimisega reaksiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga sellele iseloomulik pruun värvus lahjeneb, küllastumata rasvhapete puhul aga muutub lahus toimuva liitumisreaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin u 2ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis.
Vastavad proovid olid: 1) palmithape , 2) searasv, 3) või
Kõigisse katseklaasidesse lisasin tilkhaaval broomi lahust metüleenkloriidis ja jälgisin toimuvaid muudatusi. Palmithappega katseklaasis oli värvus kõige intensiivsem, searasvaga õrnalt kollakas ja või proovis oli lahus läbipaistev, mis tähendas, et sisaldas kõige rohkem kaksiksidemeid.
Liebermann -Burchard’i kolesterooli määramise test
Happelises keskkonnas moodustub kolesterooli reaktsioonil happe anhüdriidiga iseloomulik rohelise värvuse reaktsiooniprodukt. Olenevalt kolesterooli sisaldusest antud proovis võib roheline värv tekkida ka üle punase ja sinise vaheühendi.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin u 2ml 1) kolesterooli lahust, 2) searasva lahust, 3) oliivõli lahust, kõiki metüleenkloriidis. Igasse katseklaasi lisasin 10 tilka äädikhappe anhüdriidi ja 5-6 tilka kontsentreeritud väävelhapet ja segasin hoolikalt. Järeldused: kolesterooli lahus muutus sinakaks, searasva lahus jäi peaaegu läbipaistvaks ja oliivõli lahus muutus õrnalt rohekaks. Minu katseklaasis oli segu liiga roheline, mis võis tulla üleliia pandud äädikhappe anhüdriidist ja väävelhappest. Oliivõli proov sisaldab taimseid steroole.
Kokkuvõte:
Lipiide võib vastavalt nende molekulide ehitusele ja omadustele klassifitseerida mitmeti, näiteks rasvhapped, neutraalrasvad, fosfolipiidid, vahad, steroidid. Lähtudes seebistumusvõimest võib lipiide jagada kas siis seebistuvateks või mitteseebistuvateks. Antud töös nägime, et lipiidid lahustuvad reeglina orgaanilistes lahustites, näiteks etanoolis ning reaktsioonil halogeenidega, näiteks broomiga muudavad lahused värvust.