juuresolekul. GOx-i süstemaatiline nimetus β,D-glükoosi:O 2-oksüdo-reduktaas näitab, et ta katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D- glükoonhappe. GOx kujutab endast liit- ehk konjugeeritud valku (flavoproteiini), mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk (kaks subühikut). Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. POx on samuti koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide
- Liitvalk ehk konjugeeritud valk (flavoproteiin) - Sisaldab koeensüümina toimivat mittevalgulist komponenti FAD-i - Molekul on dimeerne valk (koosneb 2 subühikust, mis pildil kahe erineva sinisega) - Sisaldab FAD-i molekule (tähistatud roosaga) - polüsahhariidi ahelad, mis
Värvusetu Värviline Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 reedutseerimine H2O-ks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6], ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH=6 juures. Peroksüdaas 2+ 2 Fe + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Töö käik: Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme GOx ja POx, kromogeenset substraadi K4[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
Värvusetu Värviline Lisaks nimetatud orgaanilistele ühenditele võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuviljad vm taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(II). Katse käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis
skeem. Lisaks nimetatud orgaanilistele ühenditele võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. 3+¿+ 2 H 2 O ¿ +¿ Peroksüdaas 2 Fe → 2+¿+ H 2 O 2+ 2 H ¿ ¿ 2 Fe Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuviljad või muu taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös.
K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Tundmatu proovi ettevalmistamine Sidruni mahl 50ml katseklaasi valan 1ml filtreeritud sidruni mahla ja lahjendan x50 korda destilleeritud veega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Selleks, et glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlaks teha, tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel =410 nm. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (= optilise tiheduse) väärtust nimetatud lainepikkusel. Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standard-lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest
glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx-i süstemaatiline nimetus ,D-glükoosi:O2-oksüdoreaduktaas (EC 1.1.3.4) näitab, et ta katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Produktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsides moodustab D- glükoonhappe. GOx kujutab endast liitvalku, täpsemalt flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponentina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad. FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerides FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükooshapet ja vesinikperoksiidi. Järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna esindajat, rõika peroksüdaasi (EC 1.11.1.7), mille süstemaatiline nimetus on doonor:H 2O2-oksüreduktaas
.......................................... 5 Meloni lahuse ettevalmistamine.......................................................................5 Glükoosilahuste valmistamine..........................................................................5 Värvusreaktsiooni läbiviimine...........................................................................6 Katse andmed..................................................................................................... 7 Kaliibrimisgraafik................................................................................................. 7 Arvutused............................................................................................................ 7 Järeldused............................................................................................................... 8 Kasutatud kirjandus................................................................................................ 9 Sissejuhatus Laboratoorse töö 3
Analüütilistel kaaludel kaalutakse 0,1 kuni 0,2 g mett ja viiakse kadudeta 100 ml mõõtekolbi. Selleks loputatakse 2-3 korda kuuma destilleritud veega kaaluklaasi ja viiakse vedelik lehtri abil samasse mõõtekolbi. Kolb täidetakse destilleeritud veega kuni kaelal oleva märgini, suletakse korgiga ja loksutatakse hoolega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi konsentratsiooni kindlakstegemiseks tuleb koostada kaliibrimisgraafik, mis ühendab endas glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel =410 nm. X-teljel on glükoosi konsetratsioon, y-teljel absorptsiooni väärtus. Glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standardlahusest, milles on glükoosi 1,0 mg/ml. Lahjenduste konsentratsioonid: 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Kasutasin sammsammult lahjendamist. Selleks valmistatakse esmalt standardlahusest kindel maht (meie näites 10 ml)
liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem. POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril. Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (greibimahl). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Uuritava proovi (greibimahla lahjendus) ettevalmistamine: Valmistasin greibimahlast 1:100 lahjenduse. Selleks pipeteerisin automaatpipetiga 0,5 ml pigistatud greibi mahla 50 ml kolbi, täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega ning loksutasin segamini. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks:
· 3 katseklaasi kaliibrimislahustega - Igasse katseklaasidesse pipeteeritakse 3ml tööreaktiivi ja loksutakse. - Katseklaasi hoitakse 20 minutit toatmperatuuril. - Mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm lahuste optilise tiheduse väärtused. 5) Koostame kaliibrimisgraafiku. Töö tulemused. Lahus: Absorbtsiooni väärtus: Glükoosilahus 1 (0,25 0,1318 ABS mg/ml) Glükoosilahus 2 (0.125 0,0947 ABS kalibrimislahused mg/ml) Glükoosilahus 3 (0,062 0,0576 ABS mg/ml) 0-proov vesi 0,0293 ABS Uuritavad lahused Mahl 1 0.1273 ABS Mahl 2 0,1185 ABS M1 ja M2 keskmine 0
määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. ,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas katalüüsib ,Dglükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Produktideks on vesinikperoksiid ja ,Dglükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. GOx on liit- ehk konjugeeritud valk, flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk.FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Tekib ekvimolaarses koguses D- glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Järgmises etapis kasutatakse rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. POx on sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. See tähendab, et ka POx on liitvalk. POx katalüüsib
Standardlahusest valmistatakse kolm lahjendust: 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Antud töös kasutasin samm-sammulist lahjendamist. Selleks valmistasin esmalt standardlahusest 10 ml glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml, mida seejärel lahjendasin 2 korda ning saadud teist lahjendust omakorda 2 korda. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. Selleks asetatakse katseklaaside statiivi 6 puhast ja kuiva katseklaas, nummerdatakse. Kontrollkatse ehk 0-proov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni, viiakse läbi destveega. Uuritava lahusega tehakse 2 paralleelkatset, glükoosi standardlahusest valmistatud lahjendustega igaühega 1 katse. Katseklaasidesse pipeteeritakse 1 ml lahust ning 3 ml tööreaktiivi ning loksutatakse ühtlase kontsentratsiooni saavutamiseks. Fikseeritakse reaktsiooni algusaeg ning hoitakse 20 minutit toatemperatuuril. Lainepikkusel 410 nm
uuritava proovi glükoosisisaldusest. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid erinevaid orgaanilisi ühendeid. Lisaks orgaanilistele ühenditele võib substraadina kasutada K4[Fe(CN)6] (kollane veresool). POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt vesinikperoksiid redutseerub veeks. Tekkiv K3[Fe(CN)6] (punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeriv lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik: Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, milleks mina kasutasin mett. Selleks kasutasin tööreaktiivi, mis sisaldas eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi ja peroksüdaasi ja kromogeenset substraati K4[Fe(CN)6]. Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritava lahusena, milles glükoosi kontsentratsiooni määrama hakkasin, kasutasin mina mee tõmmist
Kui kasutatakse substraadi, mille oksüdeerimisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektofotomeetriliselt. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine: Taandatud substraat + H2O2 Oksüdeeritud substaat + 2 H2O POx-i toimel oksüdeeruva kromgeense substraadina kasutatakse bensidiini derivaate. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat (III), K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusele 410 nm. Reaktsioon kulgeb PO x-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. 2 Fe2+ +H2O2 + 2H+ 2 Fe 3+ +2 H2O Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on olulisene koht tööreaktiivil, mis sisaldab Gox, Pox, kaaliumheksatsüanoferraati (II) ja fosfaatpuhvrit pH 6. Tööreaktiiv oli valmistatud praktikumi juhendaja poolt. Tundmatu lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine
on detekteeritav lainepikkusel 639 nm. Mugavaks substraadiks vaadeldava reaktsiooni jaoks on kaaliumheksatsüano-ferraat (II) K4(Fe(CN)6) ehk kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe 3+- ks. Sellega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks, tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. See reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Selles töös kasutataksegi POD substraadina kaaliumheksatsüanoferraat(II). 3 Töö käik Töö eesmärgiks on glükoosisisalduse määramine tundmatus proovis. Selleks kasutatakse tööreaktiivi, mis sisaldab eelpoolnimetatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD), kromatogeenset, st reaktsiooni käigus värviliseks muutuvat substraati
sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt. O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Võib kasutada ka kaaliumheksatsüanoferraati(II), mis oksüdeerudes annab lahusele kollase värvuse (Fe2+Fe3+) ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik Eelnevalt valmistatakse tööreaktiiv (25 ml): · 2,5 mg glükoosi oksüdaasi · 1,5 mg peroksüdaasi · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0 · K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni Uuritava lahuse ettevalmistamine · Prooviks kasutatakse pressitud apelsinimahla · Lahuseks võetakse 0,5 ml mahla, pipeteeritakse see 200ml mõõtekolbi ja täidetakse
värviline Mugavaks substraadiks, mida siin töös kasutatakse, on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], (kollane veresool). POx katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] (punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas pH 6 juures. 1 2+ + peroksüdaas 3+ 2Fe + H2O 2 + 2H 2Fe + 2H2O Töö käik Töö toimus ettevalmistatud tööreaktiiviga. 25 ml tööreaktiivi sisaldab: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi 1,5 mg peroksüdaasi 16,6 ml 0,2M fosfaatpuhvrit, pH=6,0
· POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. · Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril. Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (mesi). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Töö reaktiivi koostis : (25 ml kolvis sisaldub) · 2,5 mg GOD · 1,5 mg POD · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0 · K3[Fe(CN)6] (K-heksatsüanoferraat(II)) 0,1% lahus, mis täidab kolvi märgini. Uuritava proovi (mee lahus) ettevalmistamine: 1. Kaalusin analüütilisel kaalul kaaluklaasi 0,11 g mett. 2
GOx on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes ning seetõttu saab selle meetodiga määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel, produktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis moodustab hüdrolüüsides D-glükoonhappe. GOx on liitvalk, mittevalguliseks komponendiks on FAD, mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk. FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerudes FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule. Tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Ka POx on liitvalk, mittevalguliseks komponendiks on heem, seega on hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronides vesinikperoksiidi, mille redutseerimisel moodustu vesi.
Igasse katseklaasi pipeteeritakse 3 ml tööreaktiivi ja loksutatakse kohe, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Pärast tööreaktivi lisamiseks väärvus muutus kollakaks igas kasteklaasis. Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine Pärast reaktsiooni läbiviimist koostan kaliibrimisgraafiku ja selle abil leian glükoosisisaldust sidruimahlas. Kolv Optiline tihedus (ABS) Opt. tihedus 0 proov 0 proov 0,047 Sidrunimahl 0,083 0,036 KeskmineD väärtus? Sidrunimahl 0,091 0,044 Glükoosilahus 0,25 0,203 0,156 Glükoosilahus 0,125 0,114 0,067 Glükoosilahus 0,062 0,079 0,032 Keskmine väärtus on (0,036 + 0,044)/2 = 0,04 ABS Tulemuseks on 0,02 mg/ml
teiste suhkrute juuresolekul. Glükoosi oksüdaas katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. Glükoosi oksüdaas kujutab endast joonisel näidatultki liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi , mis toimib koensüümina. Glükoosi oksüdaasi molekul on dimeerne valk (kaks subühikut, mis joonisel on eritooniliste siniste värvustega näidatud). Roosaga on joonisel näidatud FAD-i molekulid. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad, mis on tähistatud rohelisega. Glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit seob FAD, redutseerides -ks ja kannab need molekulaarsele hapnikule, mis on lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.
3.3. Glükoosisisalduse ensümaatiline määramine Kaisa Rahuoja 093421 KATB41 Tallinna tehnikaülikool Matemaatika- loodusteaduskond Bioorgaanilise keemia õppetool 3.3.Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Kaisa Rahuoja 093421 KATB41 3.3. Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Katse käik: 1. Uuritava lahuse ettevalmistamine : prooviks, milles hakatakse glükoosisisaldust määrama, on sidrunimahl. Proovi saamiseks pressisin kõigepealt sidrunist välja väikese koguse mahla (1-2 ml) ning tegin sellest praktikumi juhendaja soovituste kohaselt 50-kordse lahjenduse. Selleks pipeteerisin 0,5 ml sidrunimahla automaatpipetiga 25ml mõõtkolbi ning täitsin kolvi kriipsuni destilleer
POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H 2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. Substraadiks on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik Töötatakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: · 2,5 mg glükoosi oksüdaas · 1,5 mg peroksüdaas · 16,6 ml 0,2M fosfaatpuhver, pH=6,0; · K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahus Tundmatu lahuse ettevalmistamine Uuritav proov on melonilahus
Esimesse mõõdsin 2,5 ml glükoosi standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vett 3. Teise võtsin 5 ml lahust esimesest katseklaasist ja lisasin 5 ml destilleeritud vett 4. Kolmandasse võtsin 5 ml teisest katseklaasist ja lisasin 5 ml dest. vett. Katse tulemused optiline korrigeeritud glükoos tihedus D mg/mL kontrollproo 0,0658 0 0 v oma proov 1 0,1062 0,04 otsitav oma proov 2 0,1068 0,04 otsitav lahjendus 1 0,2451 0,48 0,25 lahjendus 2 0,1577 0,091 0,125 lahjendus 3 0,1133 0,18 0,062 Minu uuritava proovi korrigeeritud optiline tihedus oli 0,04. Nagu näha, siis joon ei alga koordinaatide alguspunktist, kuid sellegi poolest asetsevad kõik punktid ühel joonel.
I. Võetakse 1 ml standardlahust (konts. 1 mg/ml) viiakse 15 ml tuubi ja lisatakse 3 ml dest.vett, saadakse lahus nr 1 kontsentratsiooniga 0.25 mg/ml II. Võetakse 2 ml lahust 1 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 2 kontsentratsiooniga 0.125 mg/ml. III. Võetakse 2 ml lahust 2 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 3 kontsentratsiooniga 0.062 mg/ml. 3. Reaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi toatemperatuuril spektrofotomeetri küvettides. Selleks võtsin kuus kuiva küvetti ja nummerdasin neid. Küvett 1: nullproov, dest.vett 250 l Küvett 2: uuritavat proovi 250 l Küvett 3: uuritava proovi paralleel 250 l Küvett 4: glükoosilahust 1 (0.25 mg/ml) 250 l Küvett 5: glükoosilahust 2 (0.125 mg/ml) 250 l Küvett 6: glükoosilahust 3 (0.062 mg/ml) 250 l
tolidiin, mille helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Mugavaks substraadiks, mida siin töös kasutataksegi, on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik Töötadakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0; K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini.
Tallinn 2010 SISUKORD 1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA ........................... 4 1.1 VALKUDE REAKTSIOONID ............................................................................... 4 1.1.1 Biureedireaktsioon ....................................................................................... 9 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) ........................................... 10 1.1.3 Milloni reaktsioon ....................................................................................... 10 1.1.4 Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon ................................................................... 11 1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega............................................... 11 1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine) .......... 12 1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st ............. 12
1.1 VALKUDE REAKTSIOONID 1. Nimetage, millised toodud valkude reaktsioonidest on üld-, millised erireaktsioonid ja põhjendage sellist jaotust. Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi: -universaalsed e üldreaktsioonid (biureedireaktsioon-on tingitud peptiidsidemete esinemisest), mis on omased kõikidele valkudele, -spetsiifilised e erireaktsioonid (tiooli-, ksantoproteiini-, Milloni reaktsioon jt), mis on iseloomulikud ainult teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele. 2. Kirjutage aminohappe molekuli üldistatud struktuurivalem. Kuidas aminohappeid klassifitseeritakse radikaali keemilise ehituse järgi? Valkude koostises leidub 20 proteogeenseteks aminohapeteks. Mõningad valgud sisaldavad ka nn ebaharilikke aminohappeid, peamiselt üldlevinud aminohapete hüdroksü-, metüül-, fosforüül- jt derivaate.
Polaarsed mitteionogeensed radikaalid, ionogeensed radikaalid (happelised ja aluselised), apolaarsed radikaalid. 3. Kuidas tekib peptiidside? Kirjutage reaktsioonivõrrand, kasutades vabalt valitud aminohappeid. 4. Kirjutage 2 polüpeptiidahela fragmenti ja näidake, kuidas tekib biureetkompleks valguga. 5. Milliste aminohapete esinemist valgus näitab positiivne a) tioolireaktsioon Tsüsteiin - Cys b) ksantoproteiinireaktsioon Aromaatset tuuma omavad Tyr, Phe, Trp c) Milloni reaktsioon Fenoolse rühmaga aminohape - Tyr 6. Kirjeldage ksantoproteiini- ja Milloni reaktsiooni kemismi. 7. Mis on valgu isoelektriline punkt (pI)? Valgu pI näitab keskkonna pH väärtust, mille korral valgumolekulis on negatiivsete ja positiivsete laengute hulk võrdne ja valgu molekuli laeng on summaarselt 0. 8. Millistel juhtudel ei kaasne valgu denatureerumisega tema lahusest väljasadenemist? Kui lahuse pH väärtus erineb oluliselt valgu pI'st. 9. Mida tähendavad mõisted
Erakorralise meditsiini tehniku käsiraamat Toimetaja Raul Adlas Koostajad: Andras Laugamets, Pille Tammpere, Raul Jalast, Riho Männik, Monika Grauberg, Arkadi Popov, Andrus Lehtmets, Margus Kamar, Riina Räni, Veronika Reinhard, Ülle Jõesaar, Marius Kupper, Ahti Varblane, Marko Ild, Katrin Koort, Raul Adlas Tallinn 2013 Käesolev õppematerjal on valminud „Riikliku struktuurivahendite kasutamise strateegia 2007- 2013” ja sellest tuleneva rakenduskava „Inimressursi arendamine” alusel prioriteetse suuna „Elukestev õpe” meetme „Kutseõppe sisuline kaasajastamine ning kvaliteedi kindlustamine” programmi Kutsehariduse sisuline arendamine 2008-2013” raames. Õppematerjali (varaline) autoriõigus kuulub SA INNOVEle aastani 2018 (kaasa arvatud) ISBN 978-9949-513-16-1 (pdf) Selle õppematerjali koostamist toetas Euroopa Liit Toimetaja: Raul Adlas – Tallinna Kiirabi peaarst Koostajad: A
annaabi.ee 
Sisene Facebook'ga
Sisene Google'ga
Sisene LinkedIn'ga
