DNA-proovi seostumine kromosoomis on tuvastatav neil oleva märgise järgi DNA-sõrmejälgede metoodika Iga inimese sõrmejäljed on kordumatud DNA-fragmentide pikkuserinevused annavad DNA elektroforeesi käigus mustri,mis on individuaalselt sama kordmatu kui tõelised sõrmejäljed. DNA-restriktsioonanalüüs:DNA-sõrmejäljed Bioloogilisest proovist(veri,koetükk,sperma vms)eraldatakse rakutuumad DNA eraldatakse tuumadest ning restriktaaside abil lõigatakse DNA eri pikkusega lõikudeks Ühesuguse pikkusega DNA-lõigud paigutuvad eletroforeesi käigus ühte piirkonda.Eri inidviidide fragmendipikkuste muster-"sõrmejäljed"-on erinevad Polümeeraasne ahelreaktsioon Meetodi leiutajaks oli USA keemik Karly Mullis 1983. aastal Võimaldab mõne raku olemasolu korral paljundada kindlat DNA-lõiku mõne tunni jooksul miljonis koopias,mis annavad võrdlevaks uurimiseks piisavalt materjaali DNA-sõrmejälgede rakendused
Inimene ja meditsiin Helene Leht Geenitehnoloogia Kadi Jänes Kanepi Gümnaasium 2013 Geenitehnoloogia geenitehnika geenimanipulatsioon On meditsiini valdkond, mis tegeleb DNAlõikudega Eesmärgid on rakenduslikud Ajalugu 1970. aastal avastati restriktsiooniensüümid ehk restriktaasid bakterites Loodi rekombinantse DNA metoodikageenitehnoloogia baas 1978. a said restriktaaside karakteriseerimise ja uurimise eest füsioloogia ja meditsiini Nobeli preemia: Daniel Nathans, Werner Arber ja Hamilton O. Smith Geeniteraapia Normaalse geeni siirdamine raske geneetilise puudega inimese koe rakkudesse Mutantse geeni avaldumise vaigistamine Eesmärk pakkuda ravi erinevatele haigustele ja tõvedele Jaguneb kaheks: somaatiline ja sugurakke mõjutav Somaatiline geeniteraapia Ehk ravikloonimine Tüvirakke viiakse otse haigesse koesse
o Jaanimardika geen tubakasse- helendub o Taimed toodavad plastmasse o Teraviljasordid, mis võtavad õhust lämmastikku (valkude sünteesiks) o Kiskjalest hävitab teised lestalised · Geene transporditakse geenivektoritega, millele on lisatud soovitud geen · Geenivektoriteks on o Bakteri plasmiidid o Viirused o Geene sisestatakse ka kullapüstoliga, taimedesse Agrobakteriga · Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil o Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks- need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad- ,,kleepuvad otsad" o Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik liita o Erinevate DNA-de liitmisel saadakse rekombinantne DNA · Kuidas aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? o Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud
*meditsiinis: 1) pärilike haiguste ravis/diagnoosimises, 2) vaktsiinide ja inimesele vajalike valkude tootmises (seda tehakse teiste organismide, nt bakterite, viiruste, seente sees), *põllumajanduses: 1) tõuomaduste muutmisel (näiteks saab tekitada lehmi, kes toodavad oma kehas mingit inimesele vajalikku toitainet), 2) taimede sordiaretuses (taimed peavad paremini vastu ilmastikule, haigustele ja taimemürkidele ning annavad suuremat saaki). 2.Selle eelduseks oli restriktaaside avastamine bakterites 1970ndal aastal. 3.Need kaks tüüpi on: *transgeensed organismid; *nokaut-organismid. Esimesel juhul siirdatakse organismi võõrliigi genoom, mis avaldub omakorda organismis ja pärandub ka järglastele. Viimasel juhul rikutakse ära geeni struktuur mutatsiooni abil. Tänu sellele kaotatakse ära tema funktsioon. Kuna see muutus toimub DNA struktuuris, siis pärandub see ka järglastele (seda juhul, kui organism on üldse paljunemisvõimeline). 4
Väga hea näide sellisest funktsioonide kombinatsioonist on bakteri plasmiidil SLAID 5: GEENIDE ÜLEKANDMINE Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”.Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita.Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA SLAID 6: RESTRIKTAASIDE JOONIS eelmisele slaidile sarnane seletus joonise põhjal SLAID 7: KUIDAS GEENID KOHALE VIIA? SLAID 8:KUIDAS ARU SAADA KAS GEEN ON ÜLE KANDUNUD? 1)Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduv-GFP) 2)Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis. 3)Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist organismis uurida. SLAID 9:
organismide genoomi muutmiseks biotehnoloogia vahendeid.Geenitehnoloogia seisneb konkreetsete DNA-lõikude eraldamises ning in vitro (katseklaasis) töötlemises. Sellele järgneb töödeldud lõikude siirdamine, kas sama või ka muu liigi esindaja kromosoomi, plasmiidi või viirusesse.Geenitehnoloogia tekkimise oluliseks baasiks oli rekombinantse DNA metoodika loomine, mis omakorda sai alguse tänu restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamisele bakterites 1970. aastal. Restriktaasid lõhuvad DNA molekuli kaksikahelad komplementaarseteks üheahelalisteks fragmentideks, millel on nn kleepuvad otsad. Lahuses kokku viidud paarduvate otstega fragmendid ühinevad ja ensüümi ligaas abil luuakse ka kovalentsed sidemed. 8. Geenitehnoloogia arstiteaduses - Tänapäeval kasutatakse igapäevaselt geenitehnoloogiat arstiteaduses. Näiteks saab juba teha uuringuid millised
nukleiinhapete tasandil. Geenitehnoloogia Geenitehnoloogia ehk tehnogeneetika ehk insenergeneetika ehk geenitehnika ehk geenimanipulatsioon seisneb konkreetsete DNA-lõikude eraldamises ning in vitro töötlemises. Sellele järgneb töödeldud lõikude siirdamine kas sama või ka muu liigi esindaja kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Geenitehnoloogia tekkimise oluliseks baasiks oli rekombinantse DNA metoodika loomine, mis omakorda sai alguse tänu restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamisele bakterites 1970. aastal. Restriktaasid lõhuvad DNA molekuli kaksikahelad komplementaarseteks üheahelalisteks fragmentideks, millel on nn kleepuvad otsad. Lahuses kokku viidud paarduvate otstega fragmendid ühinevad ja ensüümi ligaas abil luuakse ka kovalentsed sidemed. Geeniteraapia Geeniteraapia seisneb enamasti normaalselt talitleva geeni siirdamises raske geneetilise puudega inimese mingi koe (organi) rakkudesse. Osal juhtudel seisneb
coli tüve B rakkudes paljundatud faagi edasine paljunemine on takistatud tüve K rakkudes ja vastupidi Restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem bakterites Restriktaasid – endonukleaasid, mis fragmenteerivad DNA-d spetsiifilistest kohtadest Metülaasid – modifitseerivad nukleotiide restriktaaside poolt äratuntavatest 4 – 6 bp pikkustest DNA järjestustest, kaitstes DNA-d restriktaasi eest Rakus lagundatakse võõrast DNA-d, mis ei ole antud bakteritüve restriktaasi eest kaitstud E. coli tüves RI on kirjeldatud restriktaas EcoRI ja sellele vastav metülaas, mis metüleerib adeniini
(seda tehakse teiste organismide, nt bakterite, viiruste, seente sees), *põllumajanduses: 1) tõuomaduste muutmisel (näiteks saab tekitada lehmi, kes toodavad oma kehas mingit inimesele vajalikku toitainet), 2) taimede sordiaretuses (taimed peavad paremini vastu ilmastikule, haigustele ja taimemürkidele ning annavad suuremat saaki). 2.Rekombinantse DNA metoodika loomiseni viis restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamine bakterites 1970.. 3.Esimesel juhul siirdatakse organismi võõrliigi genoom, mis avaldub omakorda organismis ja pärandub ka järglastele. Viimasel juhul rikutakse ära geeni struktuur mutatsiooni abil. Tänu sellele kaotatakse ära tema funktsioon. Kuna see muutus toimub DNA struktuuris, siis pärandub see ka järglastele (seda juhul, kui organism on üldse elu- ja paljunemisvõimeline). 4.Esimene transgeenne imetaja oli hiir, kelle genoomi oli viidud roti kasuhormooni geen
sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri. Lk 42 1. Selgitage, mida kujutab endast geenitehnoloogia ja missuguseid võimalusi see pakub. Geenitehnoloogia seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri - kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. 2. Mis oli peamine avastus, mis viis rekombinantse DNA metoodika loomiseni? Restriktaaside avastamine bakterites. 3. Millised on tehnogeneetiliselt muundatud organismide (GMO) kaks tüüpi? Võrrelge neid ja tooge välja nende erinevused. Transgeensed organismid ja geeninokaudid. Transgeensed organismi geene on siirdatud teistele võõrliikidele. Geeninokaut- nende muundamine on trangeensele vastupidine. 4. Mis liiki oli esimene transgeenne imetaja? Millal ta sündis? Esimene imetaja oli hiir ja ta sündis 1981. Aastal. 5
Lisaks basaalplaadis sisalduvale lüsotsüümile sünteesitakse ka lahustuvat lüsotsüümi, mis hävitab rakuseina. Vabaneb 200 viiruspartiklit, kogu infektsioonitsükkel kestab 25 minutit. Faag paljuneb erinevates bakteritüvedes erineva edukusega. Seda nähtust kirjeldati esmalt faag lambda ja P2 puhul. W. Arber leidis, et T4 paljunemine on osades E. coli tüvedes restrikteeritud (piiratud). Rakus on olemas metülaasid, mis modifitseerivad nukleotiide spetsiifiliselt restriktaaside poolt äratuntavatest 4 - 6 bp pikkustest DNA järjestustest. Metüleerimata DNA on substraadiks restriktaasidele, mis lõikavad DNA kleepuvate või tömpide otstega fragmentideks. Edasise degradatsiooni viib läbi rakuline nukleaas ExoV. Restriktsiooni- modifikatsioonisüsteemi bioloogiliseks funktsiooniks on võõra DNA degradatsioon (raku enda DNA on spetsiifiliselt samade restriktaaside äratundmissaitidest metüleeritud). Enamlevinud on klass I ja klass III
Geenitehnoloogia Geenitehnoloogia seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri-kromossomi, plasmiidi või viirusesse. Geenitehnoloogia tekke lähtekohaks oli rekombinantse DNA metoodika loomine. Rekombinantseks DNA-ks nim. DNA molekuli, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA- fragmendid. Selle metoodika loomise eeldusteks oli omakorda restrikatsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamine bakterite 1970. aastal. Need on omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Transgeensed organismid Tavakasutuses on pealkirjas toodud mõiste asemel levinud lihtsustatud väljend-geneetiliselt muundatud organismid, lühendiga GMO. Enamasti mõistetakse selle all transgeenseid organisme, seega organisme, kelle genoomi on siiratud mõne võõrliigi geene, mis neis organismides avalduvad ja järglastele päranduvad
suunas. Sea rakkudega saab ka inimesi ravida! geenitehnoloogia on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO. Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks. Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a. Nokautorganism organism, kellel teatud geen on maha surutud. Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen- taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid.
Produtseeritakse erinevate bakterite poolt selleks, et degradeerida ehk restrikteerida võõr DNA molekule Peremeesraku DNA on kaitstud tänu lämmastikaluste spetsiifilisele metülatsioonile Isoleeritud ja biokeemiliselt iseloomustatud on sadu restriktaase Nomenklatuur tähis tuletatakse isoleerimiseks kasutatud liigi nimest EcoRI E. coli tüvest R isoleeritud esimene restriktaas Restriktaasid Enamus restriktaase on kaksikahelalise DNA spetsiifilised Erinevate restriktaaside hüdrolüüsi tulemusena tekkivad molekulide otsad võivad olla erinevate "etteulatuvate" ahelatega Restriktaasid on endo(I) tüüpi nukleaasid DNA fragmentide katalüütiline HaeIII 5´...GGCC... 3´ fragmenteerimine leiab laialdaselt 3´...CCGG... 5´ rakendust DNA analüüsil baseeruv HinfI 5´...GANTC
mille tõttu ekspresseerus GFP erinevates rakupiirkondades. PEI polüetüleenimiin pakib DNA kokku ja interakteerub membraaniga ja difundeerub läbi membraani. 3. Millised elemendid peavad olema eukarüootses ekspressioonivektoris? Loomarakkudele mõeldud ekspressioonivektor (plasmiid) sisaldab: 1.komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (prokarüootset replikatsiooni alguspunkti, antibiootikumi resistentsusgeeni); 2.kloneerimisala (MCS) erinevate restriktaaside lõikekohad; 3.uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul); 4.reportergeeni (GFP, lutsiferaas, lacZ jt.) või märgise (tag; FLAG, myc, V5, GFP) järjestust. 5.eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust (SV40); 6.selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti. Praktiline töö III Immuunotsütokeemia 1. Mille poolest on erinevad monoklonaalsed ja polüklonaalsed antikehad?
mis suunas. Sea rakkudega saab ka inimesi ravida! GEENITEHNOLOOGIA ...on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO . Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks . Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a. Nokautorganism organism, kellel teatud geen on maha surutud. Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Kuidas geenid kohale viia? Bakteri plasmiidiga Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4
kujuneb veretüüp e fenotüüp c. Mikrosatelliidid d. SNPd - TANDEEMSED kordusjärjestused (nt ACACACAC) · ALLEELE TÄHISTATAKSE NUMBRIGA, MIS ON VASTAVUSES DNA AHELA PIKKUSEGA ALUSPAARIDES (ap VÕI bp BASE PAIRS); mõnikord (hobused) teisendatud tähestikuliseks. e. Piimavalkude polümorfism -Valgu polümorfismid aminohappe muutus peptiidahelas ühe või mitme SNP tõttu DNA kodeerivas piirkonnas (ka indel-id). Polümorfisme piimavalkude geenides saab tuvastada restriktaaside kaasabil . Muutliku DNA lõigu paljundamine. Restriktsiooni reaktsioon. Restriktsioonifragmentide tuvastamine elektroforeesiga seos jõudlusega (piima kg, v% ...) ·mõju piima tehnoloogilistele omadustele ·mõju inimtoidule (sh allergeene) 2. Põlvnemisandmete kontrollimine (ülesanne) 3. Populatsioon. Panmiktiline/ideaalne/geneetilises tasakaalus (Hardy-Weinbergi tasakaaluseadus).
Miks luuakse geeninokaudiga hiiri ? Et selgitada hiirele ja inimesele ühiste geenide fenotüüpilisi tähendusi ning inimese pärilike haiguste olemuse ja avaldumiskäigu uurimiseks. Milles seisneb tavaaretuse ja GM-tehnoloogia abil saadud taimesortide peamine erinevus ? Tavaaretuse puhul ei saa muundumine toimuda kahe erineva liigi vahel (meduus ja siga). Mis oli peamine avastus, mis viis rekombinantse DNA metoodika loomiseni ? Restriktaaside avastamine bakterites 1970. Millised on GMO kaks tüüpi ? Võrrelge neid ja tooge välja nende erinevused. Esimeseks tüübiks on transgeensed organismid, kelle genoomi on siirdatud mõne võõrliigi geene. Teiseks tüübiks on geeninoukaudiga organismid, kelle genoomis on mingi kindla geeni fuktsioon kaotatud. Transgenees on ohtlikum, ebaloomulikum. Mis liiki oli esimene transgeenne imetaja ? Millal ta sündis ?
mis suunas. Sea rakkudega saab ka inimesi ravida! GEENITEHNOLOOGIA …on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO. Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks. Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a. Nokautorganism – organism, kellel teatud geen on maha surutud. Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA juppe on komplemen- taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Restriktaas Vektor Lõigatud DNA Restrikataas (sama)
Chlorella viiruse DNA sisaldab 5mC ja 6mA jääke positsioonides, mis erinevad peremehe DNA metüleerimissaitidest. See metüleerimine toimub viiruse poolt kodeeritud 5mC ja 6mA- metüültransferaaside poolt. Lisaks modifikatsiooni-ensüümidele (mõnel viirusel kuni 18 erinevat) kodeerib PBCV-1 veel ka DNA-sait-spetsiifilisi endonukleaase (restriktaase). Seega on vetikate viirused esimeseks mitte-prokarüootseks restriktaase kodeerivaks süsteemiks. Chlorella viiruste poolt kodeeritud restriktaaside lõikamissaidid: - Võivad sarnaneda bakteriaalsete restriktaaside saitidele (nt. R.CviAI lõikab GATC järjestust). - Olla unikaalsed (nende puhul pole bakteriaalseid analooge teada). - Asuda ainult ühes ahelas – vetikate viirustele on omased ka järjestus- spetsiifilised nikeerimisensüümid (nt. lõikab Nys1-nikaas DNAd CC ja NY2A- nikaas RAG järjestuse kohalt). Nendel ensüümidel (nukleaasid ja metüültransferaasid) on oluline osa viiruse elutsüklis.
restriktaase, mis annavad erinevaid üheahelalisi otsi. Taoliselt on võimalik defineerida ka inserdi sisestamise suunda. 2. Vektorit töödeldakse aluselise fosfataasiga, Näit. CIP (calf intestin phosphatase). Selle tulemusel eemaldatakse vektori 5'fosfaat rühmad ja vektor ei religeeru iseendaga kokku. 3. Tömpide otstega DNA lõikude paremaks sisestamiseks kasutatakse ka linkereid või adaptereid. Linkerid ja adapterid on kaheahelalised sünteetilised oligod, mis sisaldavad restriktaaside poolt äratuntavaid DNA järjestusi (restriktsiooni saite) Esimeses ringis ligeeritakse adapterid või linkerid, mida võetakse DNA fragmentide suhtes suures ülehulgas, et ligeerimisel liidetaks iga fragmendiga adapterid või linkerid. Seejärel linkeritega varustatud DNA restrikteeritakse, et eemaldada linkerite ülearused osad. Edasi fragment puhastatakse ja ligeeritakse soovitud vektorisse.
Kordamisküsimused Geenitehnoloogia I Restriktaasid. Restriktaasid on ensüümid, mis lõikavad DNA-d spetsiifilise nukleotiidse järjestuse järgi. Nad teevad seda kõikide DNA’de puhul samamoodi. Neid spetsiifilisi järjestusi nimetatakse restriktsiooni aladeks. Selliseid ensüüme on leitud bakteritest kaitsmaks neid kahjulike viiruste eest. DNA kloneerimine baseerub restriktaaside avastamisel. DNA järjestuse äratundmine varieerub erinevate restriktaaside vahel, lõigates tekivad eri pikkusega “kleepuvad” üleulatuvad osad. “Kleepuvad” üleulatuvad osad võivad olla nii peaahelal kui “komplementaarsel” ahelal. Selliste otstega DNA ahelaid on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita, tekib rekombinantne DNA. Restriktaasid on ensüümid, mis katkestavad hüdrolüüsi fosfordiester sidemel, tunnevad ära 6 järjestust iga restriktaas tunneb erineva. DNA kloneerimise etapid.
Katseklaasi-põis hakkas inimeses tööle. GEENITEHNOLOOGIA ...on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO. Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks. Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a. Nokautorganism organism, kellel teatud geen on maha surutud. Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Restriktaas Vektor Lõigatud DNA Restrikataas (sama)
Bakterite jaoks on tegemist sisuliselt kaitsemolekulidega: eukarüootses maailmas nukleiinhapete omavaheline vahetamine on sisuliselt võimatu ja ainuke viis on sugulisel paljunemisel, prokarüütses maailmas on tavaline, et prokarüootsed rakud vahetavad üksteisega DNA fragmente. Bakteritel on vaja mehhanismi, kuidas eristada üksteisest oma enda DNA'd ja võõr-DNA'd, selle jaoks ongi olemas restriktaasid. Seega on erinevatel bakteriliikidel on restriktaaside äratundmisjärjestused erinevad. Kui on meil restriktaasi poolt läbi lõigatud DNA lõik katseklaasis ja lisada sinna teine DNA ja lisada ensüüm ligaas, mis uuesti moodustab fofodiestersidemed. Moodustub uus DNA molekul rekombinantne DNA. 22/10/09 Restriktaaside abil on niisiis võimalik DNA'd lahti lõigata ning DNA fragmente on katseklaasis võimalik ensüüm ligaasi abil kokku liita. Ligaas ei liida kokku kõikki molekule, seega pole see protsess 100%lise efektiivsusega
tõttu (trepi sarnased otsad.). Väga kergesti kleepuvad omavahel: aitavad bakteriofaagile moodustada rõbjast struktuuri. 2. Mis rolli mängib DNA metüleerimine restriktsiooni analüüsis? Metüleerimise abil kaitstakse DNA restriktsiooni eest. Nii nt.kaitseb E.coli oma genoomset DNA enda poolt toodetud restriktaaside eest. Sellega võib manipuleerida: välja lülitada kloonimisel, et oleks võimalik DNA lõikamist restriktaasiga selleks, et sinna ehitada huvipakkuva DNA järjestust. 3. Võrdle omavahel järgnevate E.Coli ensüümide omadusi. DNA polümeraas I Klenow fragment Sequenase Taq polümeraas 5' 3' DNA-sõltuv polümeraasne aktiivsus DNA polümeraasi ,,mutantne" vorm. 5'
Klassikaliseks näiteks on vereloome tüvirakud luuüdis. (tüvirakkude skeemi vaata lehelt). Geenitehnoloogia seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidid või viirusesse. Rekombinantseks DNA-ks nimetatakse DNA molekuli, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid. Selle metoodika eelduseks oli omakorda restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamine bakterites. Restriktsiooniensüümid ehk restriktaasid on omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelast kindlate järjestuste kohalt. Enamik lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse eri otsadest. Ensüüm ligaas toimel ühinevad ahelate otsad ka kovaletsete sidemetega ja rekombinantsed moelkulid ongi moodustunud. Osa geenitenoloogiliste meetodite juures on asendamatuks abivaheniks osutunud
eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Osa geenitehnoloogilisi meetodeid piirdub DNA uurimisega. Geenitehnoloogia tekke lähtekohaks oli rekombinantse DNA metoodika loomine (Joonis 1). Rekombinantseks DNA-ks nimetatakse DNA molekuli, milles on ühendatud eri liikidelt pärist DNA-fragmendid. Selle metoodika eelduseks oli omakorda restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamine bakterites 1970. aastal. Need on omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Enamik restriktaase lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse (4-8 nukleotiidipaari) eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised (nn. kleepuvad) otsad. Kui need fragmendid kokku viia, siis otste paardumisel nad ühinevad. Ensüüm ligaasi
Eesmärk: Sekveneerimistulemuste põhjal koostada plaan funktsionaalse ekspressioonivektori koostamiseks, millega saaks huvipakkuvat valku (liitvalguna koos GFP-ga) koekultuuri rakuloonides ekspresseerida. Töö käik: Leiame restriktaasid BamHI SalI KASUTAN C1 lugemisraami! Puhver Double Digest lehelt. BamHI buffer BamHI 2-fold excess of SalI Incubate at 37°C Mida on oluline ümberkloneerimisel silmas pidada? Inserdis ei tohi olla ümberkloneerimiseks kasutatave restriktaaside saite, kuna siis lõigataks meie kodeeritava ala keskelt fragment pooleks, aga me tahame tervet kodeeritavat ala saada. Ümberkloneerimist ei saa teha vaid ühte restriktaasi kasutades, kuna pärast me ei saaks kontrollida kumba pidi insert vektorisse siseneb. Meil on vaja aga, et ta õiget pidid siseneks, muidu me ei saa funktsionaalset valku. Doonorplasmiid pSTBlue1 vektor koos meie inserdiga Aktseptor plasmiid pEGDP-C
Selleks kasutatakse isepaljunevaid susteeme voi polumeraas-ahelreaktsioooni. Isepaljunevate susteemidena (nimetatakse ka vektoriteks) kasutatakse tavaliselt baketerite plasmiide voi viiruseid- bakteriofaage. Plasmiid rongakujuline kaheahelaline DNA molekul, mis sisaldab autonoomset paljunemist voimaldavaid geneetilisi elemente (eelkoige replikatsiooni alguspunkti), selektiivset markerit (ampitsilliinile resistentsust tagavat geeni) ja unikaalseid restriktaaside loikamiskohti (esinevad plasmiidis ainult uks kord). Vajalik DNA-loik uhendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes luhikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. Plasmiidide abil geeni paljundamise pohietapid on jargmised 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "loikamine" spetsiifilise
kudede ja organite teke. Keskkonnateguritest mõjutab loomade arengut kõige enam sööga kogus, vajalike toitainete sisaldus söödas, sööda kvaliteet, välistemperatuur, päikesekiirgus, patogeensed faktorid, pidamistingimused. Keskkonna ja genotüübi mõju osatähtsuse väljaselgitamine teatud tunnustele kasutatakse kaksikute uurimisi (ühemunakaksikutel identne genotüüp). 2. kontrolltöö 3. 1. Mis on rekombinant-DNA? Restriktaaside abil loodud DNA molekul, mis looduses ei esine. 2. Millised on rekombinant-DNA tehnoloogia põhimeetodid? DNA lõikamine restriktaasidega DNA kloonimine DNA sekveneerimine – nukleotiidse järjestuse määramine Insenerigeneetika – DNA järjestuse muutmine ja GMO-de loomine – muudetud geneetilise materjali viimine organismidesse. 3. Mis on restriktaasid? Endonukleaasid, mis lõikavad DNA-d kindlatest kohtadest (äratundmisjärjestustest – ÄJ). ÄJ
multikloneerimise koht (multiple cloning site) Marker geen Restriktsiooni ensüümid - Nö. ,,DNA käärid". Tunnevad ära teatud DNA järjestuse ja katkestavad ahela ( Eco Ri). Bakterid produtseerivad ensüüme nimega restriktsioonilised endonukleaasid. Need ensüümid lõikavad DNA ahelat kindlate 4 - 8 aluspaari pikkuste järjestuste juurest. Funktsioon: kaitsta baktereid faagide sissetungi eest, lagundades nende DNA enne, kui faag jõuab mikroobi kahjustada. Omaenese restriktaaside suhtes on bakterid resistentsed, sest bakteri enda genoomis on need järjestused kaitstud adeniini ja tsütosiini jääkide metüleerimisega. (loeng 6 meetodid) Geeni ekspressiooni disain - Promootori ja terminaatori valik Marker geen ja reporter geen Geeni ekspressiooni võimendajad ja asukohta määravad järjestused (loeng 7) Promooter - Nende abil saab muuta ekspressiooni. constitutive promooter ekspressioon toimub kogu aeg igas taime osas.
on antud restriktaasiga lõigatud fragmentide ligeerimise efektiivsus jne). Kõige sobivamad on puhver B, G ja Tango. Ensüümid töötavad 37 kraadi juures, inaktiveeruvad 65 kraadi juures, efektiivsus 95%, tundlik CpG metülatsioonile. 1.2) Kui restrikteerimiseks kasutada üheaegselt kahte erinevat ensüümi (näiteks Cfr42I ja PstI), siis milliseid puhvreid oleks kõige mõistlikum kasutada (vt Fermentase kataloogist restriktaaside tabelist)? Kas Yello Tango puhvris oleks võimalik üheaegselt lõigata Cfr42I ja SmaI ensüümidega? Parim B, sobivad ka G ja Tango. Tango puhvris on võimalik lõigata üheaegselt nende ensüümidega, kuid kuna nad on aktiivsed erinevatel temperatuuridel, siis on efektiivsus suhtselt madal. 1.3) Kui palju tuleb võtta 1 M Tris-HCl, 5 M NaCl, 20% SDS ja 0,5 M EDTA-Na 2 lahuseid, et valmistada 1 ml 2 x PK puhvrit (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,44 M NaCl, 2% SDS, 25 mM EDTA-Na2).
otste kaudu liiguvad organellid ja rakutuumad. 43. Restriktaasid. Paljud bakterid produtseerivad ensüüme, restriktsioonilisi endonukleaase e. klass II restriktaase, mis tunnevad kindlaid 4 8 aluspaari pikkusi DNA järjestusi ning lõikavad DNA d ainult nendest spetsiifilistest kohtadest. Nii kaitsevad restriktaasid baktereid näit faagide sissetungi eest, lagundades nende DNA enne, kui faag jõuab mikroobi kahjustada. Omaenese restriktaaside suhtes on bakterid resistentsed, sest bakteri enda genoomis on need järjestused kaitstud adeniini ja tsütosiini jääkide metüleerimisega. Paljude restriktaasidega lõikamise tulemusel tekivad DNA fragmendid, mille otstes on lühikesed, 2 4 nukleotiidi pikkused üheahelalised alad. Neid nimetatakse kohesiivseteks e kleepuvateks otsteks, kuna nad võivad paarduda teiste sama restriktaasiga lõigatud DNA üleulatuvate otstega
Kinetohooride vahendusel seonduvad replitseeruvad kromosoomid vastaspoolustele, kinetohoorid aitavad kromosoomidel käävis õigesti paigutuda ja hoiavad ära kromosoomide lahknemise enne, kui kõik kromosoomid on kinnitunud ja õigesti asetsenud. Kinetohoor on kolmekihiline struktuur, mis paikneb kahe kromosoomiõla struktuurse heterokromatiini vahel. Tsentromeerialade analüüs Struktuurse heterokrmatiini alasid saab kromosoomides esile tuua C-vöötide meetodil, töötlemisel restriktaaside või antikehadega ning fluorestsentsanalüüsil. Barri kehake: selle moodustab üks kahest X-kromosoomist. Barri kehakest võib leida naise teatud kudedes interfaasi rakkude tuumades, näiteks neeru, maksa ja limaskesta epiteeli diploidsetest rakkudest. Telomeer on kromosoomide otstes asuv järjestus. See hoiab ära DNA degradeerumise ehk lagundamise nukleaaside ja kromosoomide omavahelise ots-otsaga liitumise. Kromosoomiotsad sisadavad kaht tüüpi
lõigatud fragmentide ligeerimise efektiivsus jne). Kõige sobivam puhver viie puhvri süsteemis Cfr 421 jaoks on : B(blue) 100 ja Tango (yellow) 50-100. Ensüüm veel töötab G(green) puhvris. Ensüümid töötavad 37 kraadi juures,lõigatud fragmentide ligeerimise efektiivsus on 95%. 1.2) Kui restrikteerimiseks kasutada üheaegselt kahte erinevat ensüümi (näiteks Cfr42I ja PstI), siis milliseid puhvreid oleks kõige mõistlikum kasutada (vt Fermentase kataloogist restriktaaside tabelist)? Kas Yello Tango puhvris oleks võimalik üheaegselt lõigata Cfr42I ja SmaI ensüümidega? Kui kasutada üheagselt kahte erinevat ensüümi oleks mõistlikum kasutada Tango (yellow), G (green), B (blue).Yellow Tango puhvris ei ole võimalik üheaegselt lõigata Cfr421 ja Sma1 ensüümidega, kuna temperatuurid on erinevad. 1.3) Kui palju tuleb võtta 1 M Tris-HCl, 5 M NaCl, 20% SDS ja 0,5 M EDTA-Na 2 lahuseid, et
Veterinaargeneetika ja aretus 2. kontrolltöö kordamisküsimused 2015 1. Mis on rekombinant-DNA? Restriktaaside abil loodud DNA molekule nimetatakse rekombinant DNA molekulideks 2. Millised on rekombinant-DNA tehnoloogia põhimeetodid? (1) DNA molekuli lôhestamine e. lôikamine fragmentideks restriktsiooni ensüümide abil, mis lôhuvad sidemed nukleiinhapete (NH) vahel spetsiifilise nukleiinhapete järjetusega piirkonnas (iga ensüümi jaoks eri NH järjestus) (2) Nukleiinhappeline hübridiseerimine- tänu DNA, RNA molekulide vôimele siduda vabasid NHid
DNA on vastupidav leeliste suhtes; lahjades hapetes depurineeritakse, st hüdrolüüsitakse puriinnukleosiidide N- glükosiidside. Polünukleotiidahelate lõikamine. Eksonukleaasid hüdrolüüsivad fosfodiestersidet terminaalsete jääkide juurest. Endonukleaasid hüdrolüüsivad nukleiinhapete sisemisi (mitte-terminaalseid) fosfodiestersidemeid. Restriktsiooniensüümid. Bakterid kaitsevad ennast võõra DNA sissetungi eest restriktsiooniensüümide e restriktaaside abil. II ja III tüüpi restriktaasid lõikavad DNA ahelaid kindlates kohtades. Ensüümid võivad ära tunda 4-6 või rohkem aluseid potensiaalse lõikamissaidi juures. XV NUKLEIINHAPETE STRUKTUURITASEMED 1. DNA sekundaarstruktuur vesiniksidemed komplementaarsete aluspaaride vahel. Suhkur-fosfaat põhiskelett väljaspool; lämmastikalused seespool
- analüüsimeetodid võõrDNA jälgimiseks - elektroforees, hübridiseerimine 38. Restriktaasid Restriktaasid - ensüümid, mis lõikavad DNA kindla järjestuse ära (äratundmiskoht), tekivad iseloomulikud otsad. Äratundmiskohad on sageli 4-8 pikkusega. Restriktaasid lõikavad DNA ahele läbi kindlas piirkonnas, see sõltub DNA nukleeinhappelisest järjestusest. Kusjuures igal ensüümil on oma „äratundmiskoht“. Restriktaaside abiga võime saada erinevaid DNA lõike – siduvate ja tömpide otsadega. Siduvate otstega fragmendid on ühekordsete ahelatega ning neid saab taas omavahel liita. Restriktaase toodavad bakterid enesekaitseks, purustades erinevaid DNA ahelaid, jättes sellele „kleepuvad otsad“. Need jupid liidetakse uuesti komplementaarsuseprintsiibi kohaselt. Erinevate DNA lõikude liitmisel saame rekombinantse DNA. 39. Plasmiidid
meetodid (nt. kaltsiumfosfaat, katioonsed polümeerid, dendrimeerid, liposoomid ja katioonsed lipiidid) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). 121. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (originit ning antibiootikumi resistentsusgeeni) kloneerimisala (MCS) – paljude erinevate restriktaaside lõikekohad uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) reportergeeni (GFP, lacZ jt.) või märgise (FLAG, myc, V5, GFP) järjestust eukarüootset promootorit ja polüadenüleerimisjärjestust selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti 122. 123. pEGFP : võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes
ja keemilisi transfekteerimise meetodeid. Võimaldab efektiivsemalt transfekteerida rakke, mis muude meetoditega hästi ei taha transfekteeruda. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: • komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (origini- prokarüootset replikatsiooni alguspunkt, antibiootikumi resistentsusgeeni) • kloneerimisala (MCS) – sisaldab paljude erinevate restriktaaside lõikekohti • uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) • eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust(SV40) Sageli ka: • reportergeeni (GFP, lacZ jt.) järjestus • märgise järjestus(FLAG, myc, V5, GFP) • selektsioonimarkeri ekspressioonikasset Praktikumis on kasutusel pEGFP (enhanced green flourescent protein) ekspressioonivektor, mis:
funktsioone. Eriti olulised kromosoomi kui terviku säilimisel on tsentromeeri ja telomeeri alad. 1.Kromatiid 2.Tsentromeer 3.Lühike ,,käsi" 4.Pikk ,,käsi" 18. Milliseid rakke ümbritseb rakukest? Taimerakke. 19. Mis on plasmiid? Plasmiid on rõngakujuline kaheahelaline DNA molekul, mis sisaldab autonoomset paljunemist võimaldavaid geneetilisi elemente (eelkõige replikatsiooni alguspunkti), selektiivset markerit (ampitsilliinile resistentsust tagavat geeni) ja unikaalseid restriktaaside lõikamiskohti (esinevad plasmiidis ainult 1 kord). 20. Rakutsükli etapid. Rakutsükkel koosneb M-faasist (mitoos e. karüokinees(tuuma jagunemine) + tsütokinees(tsütoplasma jagunemine) e. raku pooldumine, mille puhul kromosoomid jaotuvad tütarrakkude vahel võrdselt) ning interfaasist e. päristuumse raku kahe jagunemise (mitoosi või meioosi) vahele jääv eluperiood (ajaliselt 90% vôi rohkem rakutsükli kestusest).
Fagemiidid (ekspressioonivektorid) d. Kosmiidid e. Süstikvektorid f. Kunstlikud kromosoomid 7. Restriktaasid, kloonimissait restriktaas (ingl. Restrictase)- Endonukleaas, mis tunneb ära lühikesi spetsiifilisi DNA-järjestusi ja lõikab DNA-molekuli selles restriktsioonisaidis või selle lähedalt katki. polülinker (polükloonimissait) (ingl. Polylinker, Polycloning site)- DNA-segment, mis sisaldab rea unikaalseid restriktaaside lõikesaite. 8. Kloonimisvektorid, tüübid kloonimisvektor (ingl. Cloning vector)- Väike isereplitseeruv DNA- molekul (plasmiid või viiruskromosoom), millesse geenide kloonimisel insertseeritakse võõras huvipakkuv DNA. 9. Kloonide selektsioon, positiivne, negatiivne kloonselektsioon e. klonaalne selektsioon (ingl. Clonal selection)- Organismi immuunsüsteemi reageering antigeenile. B- ja
Powerpoindist võetud tabel: Ahelate lõikamise loogika üldiselt: Alguses: Peale hüdrolüüsimist: a - fosfodiestersideme 3' pool; b - fosfodiestersideme 5'-pool b) Restriktaas EcoRI (,,kleepuvaid" otsi produtseeriv endonukleaas) restriktaas ehk restriktsiooniensüüm kaitseb bakterit võõra DNA sissetungi eest. II ja III tüüpi restriktaasid lõikavad DNA ahelaid kindlates kohtades Ei vaja ATP. Kaheahelalise DNA restriktaaside äratundmissaitidel on 2-kordne sümmeetriatelg. Sõna EcoRI tuleb E. coli (soolekepike) R liinis avastatud esimene restriktaas. c) DNA polümeraas ensüümid, mis viivad läbi DNA replikatsiooni. Polümeraas saab lisada vabu nukleotiide ainult sünteesitava ahela 3' otsa ja seepärast toimub pikendamine 5'-3' suunas. Uue ahela sünteesiks on vaja vaba 3'-OH rühmaga praimerit. 16
Mu mõõdukas faag, lüütilise tsükli ja lüsogeense staadiumiga. Mu transponeerub suvalistesse kohtadesse bakteri kromosoomi ja põhjustab seal oma genoomi replikatsiooni käigus ulatuslikke geneetilisi ümberkorraldusi. Mu faagi välja tulekul haaratakse faagi genoomiga kaasa ka külgnevat DNAd. Mu faagiga nakatunud bakterid sisaldavad palju erinevaid mutatsioone. T4 nukleiinhape on modifitseeritud, kaitsmaks teda faagi-spetsiifiliste nukleaaside ja rakuliste restriktaaside eest. Struktuursed osad (pea, saba, fiibrid) moodustuvad teineteisest sõltumatult. Infektsiooni tagajäjel inaktiveeritakse raku geenide transkriptsioon ja translatsioon. Vastavalt avaldumise ajale klassifitseeritakse geenid: varajased, keskmised ja hilised geenid. Levioni geenid: kapsiidivalk, RNAst sõltuv polümeraas, replikaas, lüüsivalk, A-valk (antiretseptor)
Mingi marker, millega saab eristada inserdiga plasmiide, mitte rekombinantsetest (näit. lacZ geen). Milleks cDNA raamatukogu kasutatakse: 1. Isoleerida ja järjestada geene, mis kodeerivad valku 2. Võrrelda eri organismide homoloogseid järjestusi 3. Määrata mRNA hulka ja geeni ekspressiooni taset rakus Restriktsioon analüüs: Geeni struktuuri määramiseks; piiranguks on restriktsiooni saitide olemasolu ja restriktaaside valik. RFLPs on väga oluline analüüs nii kriminalistikas kui fülogeneesi uuringutes (igal indiviididil erinevatel kohtadel restriktsiooni saidid, selle tulemusena ka erinevad lõikude pikkused. Meetod oluliselt odavam kui DNA sekveneerimine. DNA lõikusid saab hübridiseerida nn.Southern blotiga, ilma kloonimata. See näitab homoloogia olemasolu või ka geenikoopiate arvu. Northern Blot: Põhimõte sama mis Southern blotil, aga kasutatakse RNAd DNA asemel.
juba teadaolevate geenide asukohtade suhtes. Näiteks võiks tuua autosomaalse retsessiivse haiguse tsüstilise fibroosi (CF), mille geen lokaliseeriti aheldatuse analüüsil 7. kromosoomi. Kasutades mõlemal pool geeni paiknevaid RFLP-e kloneeriti geen, mille produkt oli siis veel tundmata Kui mutatsioon DNA-s on tekkinud restriktaasi lõikesaiti, siis seda järjestust restriktaas enam ei lõika. Mutatsioonid võivad muuta DNA järjestust ka nii, et tekivad uued restriktaaside lõikesaidid. Seega põhjustavad mutatsioonid DNA restriktsioonifragmentide mustris erinevusi, kuna võrreldes algse DNA-ga tekib mutatsioone sisaldava DNA lõikamisel mingi kindla restriktaasiga teistsuguse pikkusega fragmente. Nii võib erinevatest isolaatidest pärinev DNA olla DNA restriktsioonanalüüsi põhjal restriktsioonisaitide suhtes polümorfne erinevate isolaatide puhul tekivad erineva pikkusega restriktsioonifragmendid. Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismi
Bakterid, mida ei saa kunstlikult kompetentseks muuta, on üldiselt jäetud uurimise alt välja. Transformatsiooni efektiivsuseks nimetatakse transformantide arvu 1 g DNA kohta. E. coli puhul kasutatakse transformatsiooniefektiivsuse arvutamiseks pBR322 DNA-d. Transformatsiooni võivad takistada retsipientraku restriktaasid, mis tunnevad erinevalt metüleeritud DNA-d ära ning lõikavad transformeeritud DNA tükkideks. Selle vältimiseks kasutatakse metülatsioonidefektseid või restriktaaside defektseid tüvesid. Kunstlik kompetentsuse tekkimine on üsna segane ning sõltub bakteri liigist, puhvrist ning bakterite kasvatamisest. Sellest johtuvalt pole leitud universaalset metoodikat kõigi bakterite jaoks, vaid levinud metoodikaid kohandatakse iga liigi jaoks eraldi, otsides parimaid tingimusi. Kunstliku transformatsiooni korral on vaja leida balanss bakterite ellujäämise ja vigastamise vahel. Baktereid on vaja vigastada, et DNA pääseks rakku, samas on
annaabi.ee 
