FLU Fluorestsents spektroskoopia Õpperühm: Töö teostaja: Õppejõud: Töö teostatud: Töö kaitstud: Eesmärgid/ töö osad: 1. Dest. vee ja standardainete EEM (ergastus-emissiooni maatriksi) spektrite mõõtmine ja iseloomustamine, interpreteerimine; 2. Uurimine, kas aine fluorestsents sõltub keskkonna pH-st; 3. Vitamiinivee EEM spektri mõõtmine ja iseloomustamine, interpreteerimine; 4. Fluorestsentsi kustutamine vitamiinivee ja joodi näitel; 5. Fluorestsentsi tekitamine aluselises keskkonnas tiamiini ja punase veresoola näitel; 6. Kvantitatiivne (,,sõrmejälje") analüüs EEM spektrit kasutades. Kasutatav aparatuur Ultrahelivann Bandelin SONOREX Digital 10 P, Nartest spektrofluoromeeter Kasutatavad lahused Dest. vesi, püridoksiin (vitamiin B6), riboflaviin (vitamiin B2), sidrunhape, NaOH, tiamiin
TalTech keemia ja biotehnoloogia instituut YKA0060 Instrumentaalanalüüs FLU Fluorestsents-spektromeetria Õpperühm: Töö teostaja(d): Õppejõud: Töö teostatud (kuupäev): 1 Töö eesmärk Töö eesmärgiks oli uurida fluorestsentsi tekitamist, kustutamist ja sõltuvust pH-st. Kahe tundmatu joogi koostise iseloomustamine standardainete EEM spektritega võrdlemise meetodil. Tooniku hiniini kontsentratsiooni kirjeldamine EEM spektrite alusel. 2 Töö käik 1) Destilleeritud vee ja standardainete EEM (excitation - emission matrix) spektrite mõõtmine ja iseloomustamine, interpreteerimine. 2) Uurimine, kas aine fluorestsents sõltub keskkonna pH-st (püridoksiini ja riboflaviini näitel).
● Leegis mitte dissotsieeruvate ühendite tekkimine. ● Ionisatsioon (Ba, Ca, Sr, K, Na). Kõrvaldatakse reagentidega, mis seovad segajat tugevamini kui analüüt. Ionisatsioon kõrvaldatakse ionisatsioonsupressori abil. 25.Luminestsentsspektroskoopia põhimõte Molekul ergastatakse elektromagnetilise kiirguse neelamise kaudu ja seejärel molekul ise emiteerib energiakvante. Võimalik jälgida: ● Ergastuse kiirguse lainepikkust ● Emissiooni kiirguse lainepikkust 26.Fluorestsentsi ja fosforestsentsi olemus (Jablonski diagramm) 27.Stokes´i nihe Stokes’i nihkeks nimetatakse vahet absorptsiooni ja emissiooni spektrite vahel. Kui süsteem absorbeerib footoni, siis ta saab energiat ja ergastub. Aga kui ta kiirgab footoni siis ta annab ära energiat ja soojust. Kui kiiratud footoni energia on vähem kui absorbeeritud footoni energia, siis seda energiate vahet nimetatakse Stokes’i niheks. Märkus üks: toimub soojuse äraandmine (vibreerimisel) 28
Ionisatsioon (Ba, Ca, K). Need kõrvaldatakse reagentidega, mis seovad segajat tugevamini kui analüüt. Ionisatsioon kõrvaldatakse ionisatsioonsupressori abil. 21.Luminestsentsspektroskoopia põhimõte Luminestsents - meetod, mis põhineb sellel, et molekul ergastatakse elektromagnetilise kiirguse neelamise kaudu ja seejärel molekul ise emiteerib energia kvante. Sellega on võimalik jälgida - ergastuse kiirguse lainepikkust; emissiooni kiirguse lainepikkust. 22.Fluorestsentsi ja fosforestsentsi olemus (Jablonski diagramm) Fluorestsent - kvantide neeldumise tulemusena ergastatakse molekulid kõikidele võimalikele ergastatud sinlettolekute võnenivoodele, kust toimub kiirguseta üleminek ergastatud singletse oleku põhinivoole. Sellest olekust kiirgavad molekulid kvante laskudes kõikide ergastamata olekute võnkenivoodele. Edasi lähevad molekulid põhinivoo esimesele võnkenivoole kiirguseta ülemineku kaudu.
temperatuur 1289 ° C vahel. [2] Terbium (III) mine on suurepäraselt fluorescent, on helge sidruni-kollane värv, mis on tingitud tugev roheline kiirgusjoon koos teiste liinide oranz ja punane. Terbium (III) minu kohta suurepäraselt fluorescent kohta Helge sidruni-kollane värv, mis on tingitud tugev roheline kiirgusjoon koos Teiste liinide oranz ja punane. Yttrofluoriteerinevaid maavarasid fluoriidimaardlat võlgneb oma valkjas-kollased fluorestsentsi osaliselt terbium. Yttrofluorite erinevaid maavarasid fluoriidimaardlat võlgneb oma valkjas-kollased fluorestsentsi osaliselt terbium. Terbium kergesti oksüdeerub, ning seetõttu kasutatakse elementi üksnes teadustöö eesmärgil. Terbium kergesti oksüdeerub, ning seetõttu Kasutatakse elementi üksnes Teadustöö eesmärgil. Näiteks ühe Tb aatomist on saadud siirdada need fullerene molekule. [3] Näiteks Ühe Tb aatomist on saadud siirdada vaja fullerene molekule. [3]
11 Nefelomeetrid Kui lahuse hägusus on suur, siis muutuvad nefelomeetrid tundetuks. Kasutataks kvaliteedi kontrollil toiduainetetööstuses (jookide puhtus) ja vee analüüsil 5.4 Fluorestsents ja fosforestsents spektroskoopia Luminestsents: terminit kasutatakse tähistamaks fosforestsentsi ja fluorestsentsi koosvetuna Fluorestsents. Kvandide neeldumise tulemusena ergastatakse molekulid kigidele vimalikele ergastatud singlettolekute vnkenivoodele, kust toimub kiirguseta üleminek ergastatud singletse oleku phinivoole (10-12 s jooksul). Sellest olekust kiirgavad molekulid kvante laskudes kikide ergastamata olekute vnkenivoodele (10- 9 s jooksul). Edasi lähevad molekulid phinivoo esimesele vnkenivoole kiirguseta ülemineku kaudu
ja näidata nende spetsiifilisust Kiipide tüüpid III Pöördfaasi valgukiibid ● Kasutatakse lüüsitud koeproovi ● Eksponeeritakse uuritavale valgule vastava antikehaga ● Tuvastatakse luminestsentsiga ● Prinditakse alusele, et määrata koguseid ● Saab tuvastada modifitseeritud valke Antikehadel baseeruvad valgukiipid ● Pinnale immobiliseeritakse antikeha ● Märgistatud proov kantakse kiibile ● Seondumine detekteeritakse fluorestsentsi mõõtmisega ● Tulemuste alusel saab võrrelda valkude ekspressioonitaseme muutusi erinevates rakkudes ja kudedes Milleks on seda tehnoloogiat vaja? ● Annab võimaluse autoimmuunhaigusi õppida ja välja selgitada, miks kindlad rakud ja iseäranis just valgud on antikehade märklauaks ● Võimaldab hinnata antikehade kogust patsiendi seerumis 9000 unikaalse inimese valgu vastu ● Rakendades andmeanalüüsi meetodeid on bioinformaatikud
Fluorestsents Fluorestsents Fluorestsents - Sõna tuleb mineraalist fluoriit. Fluorestsents on valguse kiirgumine ainest, mis on eelnevalt ergastatud UV- kiirgusega või nähtava valgusega. Enamikul juhtudel omab emiteeruv kiirgus pikemat lainepikkust kui neelatav kiirgus ja seeläbi omab ka madalamat energiat. Samas, kui neelatav elektromagnetiline kiirgus on väga intensiivne, võib üks elektron neelata ka kaks footonit. Selline nähtus võib esile kutsuda fluorestsentsi, millel on lühem lainepikkus kui neelatud kiirgusel. Elektrivool elektroluminestsents on luminestsents, mis tekib aines rakendatud elektrivälja mõjul. Rakendamine Kasutatakse gaaslahendus- ehk luminestsentslampides, tahkeaine laserites, kujutisemuundurites, kujutisevõimendites. Elektroluminestsents Keemiline reaktsioon kemoluminestsents Protsess, mille käigus ühest või mitmest keemilisest ainest (lähteaine(te)st) tekib keemiliste sidemete katkemise ja
TTÜ keemiainstituut Analüütilise keemia õppetool YKA0040 Lahutusmeetodid keemias Laboratoorne töö: Eri sorti kanepitaimede leotiste uurimine EEM/KE-LED Õpperühm: YASM11 Teostaja: Ilona Juhanson Õppejõud: Piret Teostati: 16.10.15 Saar-Reismaa 1 Fluorestsentsi teooria Luminestsentsi alla kuulub igasugune valguskiirguse vorm peale kuuma keha kiirgumise. Luminestsentsi korral kaotab süsteem energiat ning kestva kiirgumise korral tuleb energiat väljaspoolt juurde anda. Juhul kui väliseks energiaks on infrapuna, ultravioletne või nähtav valgus, on tegu fotoluminestsentsiga, nagu ka fluorimeetrilises analüüsis. Fosforestsents on fotoluminestsentsi liik, mis erineb fluosestsentsist seeläbi, et
Seetõttu tekib lainete interferents. Tänapäeval kõik on interferentsmeetodil kasutusel. 1.5. FLUOROMEETRIA. Põhineb ergastatud molekuli võimel anda osa üleliigset energiat ära valguskvandina. Kui molekul absorbeerib elektromagneetilist kiirgust ja tõuseb stabiilselt energiatasandilt kõrgemale ebastabiilsele tasandile, siis ta annab losaenergia ära soojendusenergiana kokkupõrgetel teise molekulidega. Fluoromeetrias mõõdetakse uuritava aine fluorestsentsi intensiivsust: Kus F- fluorestsentsi üldine intensiivsus (kvanti/sec) Jo erfastava valhuse intensiivsus (kvanti/sec) C lahuse konts (mooli/l) (E) molaarne neeldumiskoeff b- fluorestseeruva kihi paksus (cm) fluorestsentsi kvant-saagis (sõltub aine om-st) Valem kehtib lahuse suhtes, mille opt.tihedus D ei ületa 0,05, millele vastab opt.läbitavus 89%, sest suure opt.tiheduse juures kiirgus ei levi lahuses ühtlaselt
Röntgenülesvõtte tegemisel läbib kiirgus objekti ja kiirgujaotust mõõdetakse juba objekti taga. Röntgenkavandid tekkivad vastastikuse mõju tulemusena elektronide pidurdumisel röntgenitoru anoodil. Röntgenkiirte saamine · Metallobjekti pommitamine kõrge energiaga elektronidega Röntgenkiiretoru Skaneeriv elektronmikroskoop · Ainele primaarse röntgenkiirte kimbu suunamine ning sekundaarse kimbu saamine fluorestsentsi teel · Radioaktiivse allika abil · Sünkrotroni abil Väga kallis Väga kõrge intensiivsus, väga monokromaatne Infrapunane kiirgus Infrapunakiirgus on elektromagnetkiirgus, mille lainepikkus on suurem kui nähtaval valgusel ja väiksem kui raadiolainetel. Nimi tähendab ,,allapoole punase", sest punase valguse lainepikkus on suurim nähtava valguse spektris. Infrapunakiirgus on ligikaudse lainepikkusega 750 nm kuni 1 mm. Infrapunane kiirgus meditsiinis
Kibe maitse - kaitse ärasöömise eest · Keskkonna kujundamine soodsamaks · Vajalikud füsioloogilistes protsessides · Jääkproduktid Uurimismeetodid: 1. Värvustestide meetod ± teatud kindlate ühenditga reageerides annavad paljud samblikuained kindla värvusega produkte; see värvuse muutus on talluse pinnal jälgitav, mille põhjal tehaksegi oletusi, millised ained võiksid uuritavas samblikus sisalduda. 2. Talluse fluorestsentsi vaatlus UV kiirguses (lainepikkusega 366 nm) - erinevad samblikuained kasfluorestseeruvad või mitte; kuifluorestseeruvad, siis fluorestsentsivärvus ja selle intensiivsus erinev. 3. Õhukese kihi kromatograafia (TLC - thin layer chromatography) - standardiseeritud meetod samblikuainetetäpseks määramiseks; võimaldab lahutadaja identifitseerida ühes eksemplarissisalduvaid erinevaid samblikuaineid. 9. Ülevaade lihhenoindikatsiooni põhimõtetest ja meetoditest
tavaolekusse, mille tulemusena eraldub valgus. Stokesi reegel: normaalolekus paiknevad elektronid madalaimal võnkenivool. Kui süsteem (molekul/aatom) neelab footoni, saab süsteem energiat ja siseneb ergastatud olekusse. Ergastatud olek ei ole molekuli jaoks stabiilne ja kokkupõrgetel teiste molekulidega ta kaotab energiat. Järgmiseks langeb molekul tagasi elektroni põhioleku mõnele võnkenivoole, mille käigus kiiratakse footon. Fluorestsentsi käigus kiiratud footon on reeglina väikesema energiaga kui ergastamiseks kasutatud footon. Seetõttu on ainest kiiratud valgus pikema lainepikkusega kui tema ergastamiseks kasutatud valguskiirgus. Nende lainepikkuste erinevust nimetatakse Stokesi nihkeks. Jablonski diagramm: 2 Derivatsireerimine: ehk funktsionaalrühma modifitseerimine- on võte, kus
28. dets. 1895 andis ta Würzburgi ülikooli füüsikalis-meditsiinilise seltsi eesistujale üle esialgse teadaandena oma töö 'Ühest uuest kiirteliigist" ("liber eine neue Arl von Strahlen"). 23. jaan. 1896 pidas Röntgen samas seltsis ettekande demonstratsioonidega. Esimesele tööle järgnesid teine (1896) ja kolmas (1897). Neis töödes on Röntgen täpselt ära määranud uute kiirte mitmesugused omadused, nagu sirgjooneline levik, fotograafiline ja ioniseeriv toime, fluorestsentsi tekitamine, seni tuntud kiirtele läbipaistmatutest kehadest läbitungivus, neeldumine, kiirte kalkus. Hoolimata Röntgeni uurimuste põhjalikkusest jäi küsimus röntgenikiirte loomusest siiski lahtiseks. See sai selgeks alles pärast hajunud röntgenikiirte polarisatsiooni (Barkla 1905), kiiruse (Marx 1905) ja interferentsi (Laue 1912) kindlaks tegemist. Röntgeni uurimistöö oli niivõrd põhjalik, et uued põhjapanevad uurimused järgnesid alles 10 ja enama aasta pärast.
2 nädal. 1. Rakutsükkel (RT) a. Mis asi see on Raku eluperiood ühest jagunemisest teiseni. b. RT faasid M-faas (ProMeAnTel) ja Interfaas (G1, S, G2) c. DNA hulga muutus RT käigus G1 -2n; S 2n->4n, G2 -4n; M 4n->2n 2. DNA värvid a. Milliseid on Etiidiumbromiid, DAPI jne. Positiivse laenguga. b. Fluorestsentsi intensiivsuse sõltuvus DNA hulgast Mida rohkem on DNA-d, seda intensiivsem on fluoresents. 3. RT tuvastamise võimalused a. Kõikide võimaluste eelised ja puudused Fluoressents - aeglane, ebatäpne. Aga näed ise oma silmaga Läbivoolutsütomeetria masin (peab vaid lootma, et ei valeta), kiire, konkreetne. 4. Läbivoolutsütomeetria a. Kuidas tulemused näevad välja ehk graafikud
kahjustuse mõõtmiseks, kvaliteedikontrolliks ja proovide valideerimiseks, genotüpiseerimiseks, patogeenide detekteerimiseks. Kvantifitseerimiseks, kasutatakse fluorestseeruvaid värvaineid (fluorofoore). Põhietapid: 1) PCR produkti kogust mõõdetakse pärast iga tsüklit (reaalajas) 2) Fluorestseeruvat signaali jälgitakse reaktsiooni kestel ja tema intensiivsus korreleerub moodustunud PCR produkti hulgaga 3)Seatakse mingi värvi fluorestsentsi intensiivsuse lävi ülalpool baasfluorestsentsi ja allpool maksimaalset fluorestsentsi 4)Ct (threshold cycle) – lävetsükkel, s.o tsükli number, mil fluorestsents ületab seatud läve 9. Mille poolest PCR erineb RT-PCR-st? 10. Mis on GMO? GMO – on geneetiliselt muundatud organism, mille pärilikkustegureid (genoomi) on inimese poolt muudetud viisil, mida looduses ei esine. 11. Millal leiab aset geneetiline muundamine? Mida ei loeta geneetiliseks muundamiseks?
energeetiliselt kõrgemasse ergastatud olekusse, millest ta reeglina veidi aja möödudes langeb tagasi stasionaarsesse põhiolekusse, kiirates lisa energia footonina. Paljude mooduste hulgas elektron suurema energiaga olekusse siirda on üks, selleks on fluorestents. Vastava lainepikusega valgus tõstab elektroni põhiolekust välja, kuid elektron pöördub sinna valgust kiirates ruttu tagasi. Tavalistel tingimustel tingimustel, juhul kui fluorestsentsi kutsub esile aine kiiritamine valgusega, ergastatakse kõrgemasse olekusse ainult tühine murdosa valgustavata aine aatomitest. Enamikus aatomitest jäävad elektronid põhiolekusse. Kui aga fluorestsentsi tekitada suure energiaga, intensiivse kontsentreeritud valgusvälgatuse abil, siis on lühikese ajavahemiku vältel ergastatud olekus rohkem elektrone kui põhiolekus, see tähendab seda et kõrgema energia tasemel olevate elektronide arv ületab madalamal energiatasemel olevate
4. 8. Milleks kasutatakse kvantitatiivset polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on RT-PCRi põhietapid? * Patogeenide (sh viiruste) kvantiteerimine ja identifitseerimine * geeniekspressiooni kvantiteerimine * DNA kahjustuste mõõtmine * proovide valideerimine * genotüpiseerimine (geenikaardi loomine). Lisatakse fluorestseeruvat värvainet (SYBR Green). Termotsükleril on fotodetektorid fluorestsentsi mõõtmiseks. Seatakse fluorestsentsi intensiivsuse lävi ülevalpool baasfluorestsentsi (nii et mõõtmine toimuks eksponentsiaalses faasis). Ct on lävetsükkel – tsükli number, mitu korda fluorestsents on ületanud seatud läve. Fluorestsentssignaali jälgitakse reaktsiooni kestel ja intensiivsus vastab moodustunud PCR produkti hulga, mida mõõdetakse pärast igat tsüklit. Faasid: 1. eksponentsiaalne (produkt kahekordistub igas tsüklis) - mõõdab RT PCR. 2
transkriptsiooni. ddNTP-l puudub 3' otsa hüdroksüülrühm (esineb H) ning pärast seda, kui neid lülitakse ahela sisse süntees lõpeb. Igasse reaktsiooni pannakse erinevat ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Siis saadud fragmendid kantakse geeli peale ja teostatakse elktroforeesi, saadakse ,,sekveneerimise treppi", mille abil võib määrata nukleotiidset järjestust. Praegu see protsess on automaatne, mis toimub spetsiaalses masinas, kasutades fluorestsentsi värvust ja detektorit. Arvuti ise loeb järjestuse ära, visualiseerides neid piikidena, iga piik vastutab oma nukleotiidile. Mõnikord kasutatakse dGTP analoogid, kuna need on lihtsama struktuuriga.
Nähtava valguse ja ultraviolettkiirguse piirkonnas eelavad ained, millede koostises on kaksiksidemeid, eriti hästi aga aromaatseid tsükleid sisaldavaid rühmi. Selliseid rühmi nimetatakse kromofoorideks. Lahuse optiline tihedus A (absorbance) avaldub: kus Io valgusallikast tuleva valguse intensiivsus ning I - lahuse läbinud valguse intensiivsus. Valguse neeldumist kirjeldab Lambert-Beeri seadus: Fluorestsents-spektroskoopia: Fluorestsentsi võib kirjeldada järgmise skeemi abil: Fluorestsents-spektroskoopia on umbes 100 korda tundlikum kui spektrofotomeetria. Looduses on väga vähe piisavalt tugeva fluorestsentsiga ühendeid. Seetõttu kasutatakse sünteetilisi substraate, mille koostisesse on viidud fluorogeenseid rühmi. F fluorestsentsi intensiivsus Io - ergastava kiirguse intensiivsus - ekstinktsioonikoefitsent c - molaarne kontsentratsioon l - neelava kihi paksus Q - kvantsaagis
Kui valgu aiminohappelise järjestuse lõhkumine ei õnnestu trüpaasi produktide põhjal, siis on vajalik peptiidide edasine lõhkumine tandem-mass- spektromeetriat kasutades. Elektromagnetiline kiirgus 20. Millisteks mõttelisteks osadeks jagatakse elektromagnetilise kiirguse spekter ja milliseid protsesse vastavad spektriosad ergastavad aatomites ja molekulides? Selgitada erinevust emissiooni, absorbtsiooni ja fluorestsentsi nähtuste vahel. Miks mõned molekulid fluorestseeruvad ja teised mitte? Spektri jagunemine- raadio laine, teraherts, infrapunakiirgus, nähtav valgus, UV-kiirgus, röntgenkiirgus, gammakiirgus. Protsessid- Absorptsioon- kui kvandi energia sobib aatomi mõnede energianivoode vahega toimub resonants: aatom neelab EM kiirguse energiat ja läheb kõrgemale energia nivoole, toimub adsorptsioon.
silmale nähtam atu elektro m a g n e e tilis e spektri UV ala, näit. lühilain elin e UV valgu s molekulide poolt ümb er m u u n d atak s e , nii et ta nend elt nähtava valgu s e n a tagasi pe e g el d atak s e . Kui näiteks aktiiniat Anemonia sulcata pimedas kiiritatakse, helendavad püüniskombitsad punaka valgusega, mis kohe kaob, kui UV kiirgus katkestatakse. Kuna spektri UV osa neelatakse vee pinnakihis, siis ei oma fluorestsentsi nähtus bioloogilist tähtsust. Fotosüntees Fotosüntees on roheliste s taime d e s ja fotosünte e sivat e s bakterites kulgev prots e s s , mille käigu s valgu s e n e r gia muu d etak s e orgaaniliste ühen dite ke e milis e k s en er giak s. Vetikate ja kõrg e m at e taime d e puhul avaldub fotosünte e s väliselt CO2 neela mi s e s ja O2 eraldu mis e s keskkon d a. Väliske skk on n a st neelatud en er gia
Tuntakse näiteks elektrokeemilisi, termokeemilisi ja optilisi biosensoreid. Sensorelemendi töö aluseks on ikka bioloogiline reaktsioon. Edasise transduktsiooni (reaktsiooni muutmisel signaaliks) tagajärjel mõõdetakse näiteks: · voolutugevust (elektrokeemiline); · elektroodide potentsiaalide vahet (elektrokeemiline); · muutunud elektrijuhtivust, mis tulenes ioonide sisalduse muutumisest reaktsiooni käigus (elektrokeemiline); · reaktsiooni soojusefekti (termomeetriline); · fluorestsentsi kustumist/teket (optiline). Enim kasutatakse elektrokeemilisi biosensoreid. Elektrokeemilise biosensori lihtsustatud tööpõhimõte. Vaatleme siinkohal elektrokeemilise, täpsemalt amperomeetrilise voolutugevuse mõõtmisel põhineva biosensori üldist tööpõhimõtet. Tegemist on nn ensüümelektroodiga, kus kasutatakse ensüümide poolt katalüüsitud redoksreaktsioonide käigus tekkiva redokselektronide voo mõõtmist.
elektron üle energeetiliselt kõrgemasse ergastatud olekusse, millest ta reeglina veidi aja möödudes langeb tagasi statsionaarsesse põhiolekusse, kiirates neelatud lisaenergia footonina. Paljude mooduste hulgas elektron suurema energiaga olekusse siirda on üks - fluorestsents. Vastava lainepikkusega valgus tõstab elektroni põhiolekust välja, kuid elektron pöördub sinna valgust kiirates ruttu tagasi. Kui fluorestsentsi kutsub esile aine kiiritamine valgusega, ergastatakse kõrgemasse olekusse ainult tühine murdosa valgustatava aine aatomitest. Enamikus aatomites jäävad elektronid põhiolekusse. Kui aga fluorestsentsi tekitada suure energiaga, intensiivse kontsentreeritud valgusvälgatuse abil, siis on lühikese ajavahemiku vältel ergastatud olekus rohkem elektrone kui põhiolekus kõrgemal energiatasemel olevate elektronide arv ületab madalamal energiatasemel olevate elektronide arvu pööratud
139. Rakkude immuunotsütokeemiline värvimine 140. Eesmärgiks on tutvustada immuunotsütokeemia ja fluorestsentsmikroskoopia meetodeid rakkudes molekulide ja rakukomponentide asukoha uurimiseks. 141. Fluorestsents - aine omadus emiteerida valgust pärast ergastamist kindla lainepikkusega kiirgisega. Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. 142. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid.
292. Kontiigid: DNA kattuvad alad (segmendid) või kogum kattuvaid kloone, mille põhjal saab moodustada DNA pidevjärjestusecvõi konkreetse kromosoomipiirkonna füüsilise kaardi 293. Fluoresentsmärgistus: Meduusist pärit roheliselt fluorestseeruv valk GFP- GFP-valgu järjestuse saab sisse viia uuritava geeni ette (variant 1) või järele (variant 2) ilma geeni poolt kodeeritava valgu funktsiooni muutmiseta, hübriidvalk on fluorestsentsi tõttu jälgitav elusates rakkudes, kudedes ja organismis. 294. Mikrokiibid: diagnostiline meetod, kus ränikihiga klaasile on korrapäraselt üliväikestesse sektoritesse seotud tuhendeid in vitro sünteesitud lühikesi diagnostilisi geeniproove, mis hübriiduvad vaid DNA täieliku homoloogsuse korral, saab uurida genoomi saite 295. Inteinid: Inteinid on iseseisvalt DNA-fragmendilt sünteesitud valgud, mis transleeritakse koos peremeesgeeni valguga,
rakud annavad rohelise signaali EFGP (rohelised täppid). Kui võrrelda tihedused, siis on kindlasti näha, et rohelist signaali rakke on 2x vähem, seega tranfekteerimise effektiivsus on umbes 50%. Aga kuna signaal on, saab järjeldada, et plasmiidid on raku sees ja tranfekteerimine õnnestus. Rakkude immuunotsütokeemiline värvimine Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. • Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt • Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid.
Viimaste esindajateks on VHF radarid. Lühem lainepikkusega radari kiirgus suudab tungida vaid puuvõrade ülemistesse osadesse. Ei sobi nt puist tagavara hindamiseks, väärtused küllastuvad kiiresti. Tundlik maapinna kalde suhtes. 16. Kõrglahutusega spektraalanalüüsi kasutamine taimkatte kaugseires. (Klorofüllisisalduse määramine, lehtede veesisalduse määramine, ksantofülli tsükli kaugseire). 17. Fluorestsents. (Fluorimeetrid, taimede fluorestsentsi kasutamisest kaugseires). Võimaldab diagnoosida taimede füsioloogilist seisundit. Fluoromeeter kasutab lühikesi moduleeritud valgusimpulsse taimelehe fotosünteesi mõõtmiseks. Lehes neeldunud valgusenergia kasutatakse fotosünteesiks, muutub soojuseks või kiiratakse välja fluorestsentskiirgusena. Viimased kaks on olulised siis, kui kiirgus on liiga intensiivne või stressi olemasolu korral. KASUT STRESSI AVASTAMISEKS VÕI SELLE TUGEVUSE HINDAMISEKS.
juhtivus, veepotentsiaal, ksüleemivoolu kiirus)? CO2 ja veeauru kontsentratsiooni mõõtmiseks - Infrapuna-gaasianalüsaator. Ksüleemivoolu intensiivsuse mõõtmiseks – nt Dynagage sensorid, mis töötavad tüve soojusbilansi meetodil. Veepotentsiaali - refraktomeetriga Organismide gaasivahetuse (CO2, veeaur, NOx) mõõtmiseks on olemas erinevat tüüpi kambrid koos gaasianalüsaatoritega LI6262, Ciras-2 (koos fluorestsentsi mõõtmisega ja ilma) Õhutemperatuuri mõõtmiseks - Psühhromeetrid koosnevad kahest elavhõbeda termomeetrist nn. kuivast- ja pidevalt niisutatavast märjast termomeetrist, milledest esimesega mõõdetakse õhutemperatuuri ja teisega õhuniiskust. Õhulõhede juhtivuse mõõtmiseks – Poromeeter, võrreldakse lehe juhtivust augustatud plaafdi juhtivusega. Õhulõhede juhtivus kirjeldab CO₂ sisenemise ja veeauru väljumise hulka lehes. Enamasti
60. Peamised tsütogeneetika meetodid; Giemsa, FISH, võrdlev genoome hübridiseerimine GIEMSA: ● Töötati välja keemiku Gustav Giemsa poolt 70ndatel ● Kromosoomid töödeldakse trüpsiiniga, mis lõhub histoonid ja siis värvitakse Giemsa värviga (metüleensinine, eosiin ja ažuur B) ● Giemsa värv seondub DNA fosfaatrühmadega ● Esile tulevad mittetranskribeerivad alad ● Kasutatkse karüotüübi analüüsiks. Saadud korrastatud pilt on karüogramm. FISH: fluorestsentsi in situ hübridiseerimine ● Kasutatakse üheahelaliste DNA proovide hübridiseerimist metafaasi kromosoomsele DNA-le ● Proov seondub ainult sinna, kus on tema järjestusele vastav komplementaarne DNA järjestus metafaasi kromosoomis ● Proovid on märgistatud fluorokroomidega ja seda on võimalik vaadelda fluorestsentsi mikrosoobis ● Kasutatakse tsentromeeridele ja igale kromosoomile spetsiifilisi proove. Võrdlev genoomne hübridisatsioon:
tehakse alternatiivne splaissing ja siis on juba halvasti. ApoE teatav haplotüüp (variant) on Alzheimerile väga soodus. Mis siis, et esmapilgul pole üldse seotud sellega. Mittekodeerivad SNPd võivad muuta ekspressioonitaset. Teatud genoomiblokid on konserveerunud SNPde poolest. · Minisekveneerimine: 1 kaupa märgistatud nukleotiidide lisamine. · Reaalaja PCR spetsproovidega, SNPde deletsiooniks. Mõõdetakse fluorestsentsi teket. · Polümeraasipõhine ekstensioonitehnika 17. TaqMan ja Molecular Beacon töötamisprintsiip Homogeensed hübridisatsioonitestid, kasutades reaalaja PCR-i ja fluorostsentsil põhinevat detektsiooni. Põhinevad energia ülekandel, kus fluorestsents detekteeritakse tänu muutusele füüsikalises distantsis fluorokroomi ja vaigistaja vahel pärast proovide hübridisatsiooni. Iga SNP vajab spetsiaalpraimerit. Kõige efektiivsemad väheste SNP-de ja suure hulga proovide puhul. 18
• • • • CNV-de määramine genoomis: põhimeetodid (CGH, SNP-kiibid, ‘paired-end’ sekveneerimine), plussid ja miinused. • CGH – comparative genomic hybridization – kasutatakse uuritavas DNA proovis teatud geenide või DNA lõikude koopiaarvu muutuste või deletsioonide leidmiseks. • Referents-DNA ja test-DNA märgistatakse erinevate fluorestseeruvate märgistega, segatakse kokku ning hübridiseeritakse kiibile. Fluorestsentsi suhteid kasutatakse piirkondade detekteerimiseks test ja referents proovide vahel, mis erinevad koopiaarvult. Saab visualiseerida deletsioone ja duplikatsioone väga väikestes DNA segmentides Saab uurida tervet genoomi ilma varasema teadmiseta kromosomaalsete aberratsioonide kohta Ei vaja spetsiifilisi sonde Saab detekteerida amplifitseeritud geenide olemasolu vähis ja kaardistada nende asukoht
monoklonaalsete antikehadega, mis on spetsiifilised pinnavalkudele nagu CD3 ja Thyl 2. Nii kinnituvad sinna ainult need rakud, millel on mõlemad valgud olemas ja neid saab taastada ettevalmistamisest adhesiooniga väikesele magnetile katseklaasi küljel. Veel saab läbivoolu tsütomeetriaga mõõta raku DNA ja RNA sisu ja määratleda selle üldist kuju ja suurust. FACS-iga saab samaaegselt teha raku suuruse (hajuv valgus) ja DNA koguse (fluorestsentsi eraldamine DNA- siduva värvi korral) mõõtmisi. Analüüsi käik kontsentreeritud märgistatud rakkude lahus segatakse puhvriga nii, et rakud läbiksid laserkiirt ükshaaval. Mõõdetakse nii fluorestseeruva valguse eraldamist kui valguse hajutamist (suurus ja kuju). Lahus viiakse läbi tila, kus moodustavad pisikesed tilgad, kus on enamasti ainult 1 rakk. Moodustumise ajal antakse igale tilgale negatiivne elektriline laeng, mis on võrdeline selle eraldatud fluorestsentsiga
nivoole, sest sai kvandienergia juurde. Kõik, mis neelavad, need ei fluorestseeru. Fluorestsents on erijuht, kus osa energiast antakse tagasi valguskvandina, osa läheb aga soojuseks (osa energiast läheb kaduma seega). ex väiksem kui em, ex on ergastus, em on emissioon. Ergastuslainepikkus on alati madalam emissioonilainepikkus. Mida väiksem lainepikkus, seda kõrgem on energia". Eeliseks on see, et me mõõdame täisnurga all fluorestsentsi fluoromeetria puhul me mõõdame väikest muutust pimedal taustal, tausta pm pole. Emissioonivalgus läheb igasse suunda, mõnel küvetil on peeglid, mis võimendavad signaali. Fluorestsents on seda tugevam, mida suurem on ekstinktsioonikoefitsient ja kvantsaagis. Kvantsaagis näitab seda tõenäosust, et ergastusenergia antakse ära emissiooni kaudu (alati võib energia minna ka soojuseks), kvantsaagis on headel fluorofooridel 1,0 lähedal.
annaabi.ee 
