FLU Fluorestsents spektroskoopia protokoll (0)

TTÜ Keemia ja biotehnoloogia instituut
Analüütilise keemia õppetool
YKA3411 Instrumentaalanalüüs
FLU
Fluorestsents spektroskoopia
Õpperühm:
Töö teostaja:
Õppejõud:
Töö teostatud:
Töö kaitstud:
Eesmärgid/ töö osad:
1. Dest. vee ja standardainete EEM ( ergastus -emissiooni maatriksi) spektrite mõõtmine ja iseloomustamine , interpreteerimine;
2. Uurimine, kas aine fluorestsents sõltub keskkonna pH-st;
3. Vitamiinivee EEM spektri mõõtmine ja iseloomustamine, interpreteerimine;
4. Fluorestsentsi kustutamine vitamiinivee ja joodi näitel;
5. Fluorestsentsi tekitamine aluselises keskkonnas tiamiini ja punase veresoola näitel;
6. Kvantitatiivne („sõrmejälje“) analüüs EEM spektrit kasutades.
Kasutatav aparatuur
Ultrahelivann Bandelin SONOREX Digital 10 P, Nartest spektrofluoromeeter
Kasutatavad lahused
Dest. vesi, püridoksiin ( vitamiin B6), riboflaviin (vitamiin B2), sidrunhape , NaOH , tiamiin (vitamiin B1), hiniin (=kiniin), jood , punane veresool ehk kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6].
Proovid : vitamiinivesi ( Vichy Vitamin Sport ), toonik (Schweppes’ TonicWater)
Töö käik
Kasutatud ergastamine lainepikkused on 230-400 nm ning emiteerimise lainepikkused on 250-615 nm.
Mõõta tuli destilleeritud vee ja standardlahuste riboflaviin ning püridoksiin EEM spektrid .
Tulemused:
1. Maksimumid:
Destilleeritud vesi. Intensiivsus (maksimum): 132,6
Riboflaviin. Intensiivsuse maksimum: 4780,4..............................................................................
Püridoksiin. Intensiivsuse maksimum: 7418,9
Järeldused
Destilleeritud vesi ei fluorestseeru, sest seal ei sisaldu flourestseeruvaid aineid. Saadav fluorestsentsspektraalkujund (SFS) kujutab ergastava valguse vee molekulidel mitteelastset hajumist ehk Ramani hajumist. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Riboflaviin fluorestseerub; püridoksiin fluorestseerub samuti ja peaaegu poole tugevamalt, kui riboflaviin. Riboflaviini intensiivsuse maksimum toimub ergastuslainepikkuses 365 nm ja emissioonilainepikkuses 530 nm. Püridoksiini intensiivsuse maksimum toimub ergastuslaine-pikkuses 320 nm ja emissioonilainepikkuses 390 nm. . . . . . . . . . . . . . . .
2. Riboflaviin+ sidrunhape, pH= 2. EEM spekter :
Ergastus-ja emissioonilainepikkused on iseloomulikud riboflaviini mole -kulile. Happeline keskkond seega ei reageeri riboflaviini fluorestsentsi ja saab edukalt antud aine tuvastada. .
Seega happelises keskkonnas saab riboflaviini edukalt tuvastada.
Riboflaviin+ NaOH, pH= 9. EEM spekter:
Siin on selgelt näha, et aluselises keskkonnas riboflaviini fluorest-sentsi intensiivsus väheneb suurel määral, fluorestseeruvus on peaaegu kadunud. . . . . . .
NaOH ei kustuta, vaid pilti mõjutas aluseline keskkond. Järelikult aluselises keskkonnas pole võima-lik riboflaviini olemasolu tõestada.
Püridoksiin+ sidrunhape, pH= 2. EEM spekter:
Happelise keskkonnaga püridoksiini EEM spekter nihkus pisut paigast ära, võrreldes standard püridoksiini EEM spektriga . Intensiivsus märga-tavalt ei vähenenud , seega happe-line keskkond püridoksiini fluorest-sentsi ei kustuta. . . . . . .....................................
Seega püridoksiini aluselised rühmad fluorestreeruvad happeli-ses keskkonnas teisiti, spektraal-kujund muutub ning sellepärast pole ta enam kergesti äratuntav.
Püsidoksiin+ NaOH, pH= 9. EEM spekter:
Aluselise pH-ga püridoksiini lahuse EEM spekter on väga sarnane standardlahuse püridoksiini EEM spektrile ehk iseloomulik püridoksiini spektrile, mistõttu tema olemasolu lahuses saab siin hästi tuvastada.
Samuti fluorestsentsi intensiivsus aluselises keskkonnas isegi suure-nes.
Järeldused
Nii püsidoksiini kui riboflaviini puhul sõltub fluorestsents keskkonna pH-st. Riboflaviini puhul sõltub keskkonna pH-st suuresti aine fluorestseeruvus, mis puhul aluselises keskkonnas kustub fluorestseeruvus. Seega riboflaviini saab tuvastada happelises keskkonnas, aluselises keskkonnas ta fluorestsents kustutatakse. Püridoksiini spektraalkujund nihkus paigast happeli-ses keskkonnas, aluselises keskkonnas oli aga püridoksiin hästi äratuntav.
3. Vitamiinivesi. EEM spekter:
Vitamiinivees sisaldub punktis 1 kasutatud vitamiinidest püridoksiin ehk vitamiin B6, selle spektraal-kujund on talle iseloomulik ning sellega on aine tuvastatav.............
Intensiivsuse maksimum: 459,5 (ergastus/emissioon 300/395 nm juures).
Fluorestsents on madal, see tuleneb väiksest püridoksiini kogusest vita-miinivees.
4. Vitamiinivesi+ 2 tilka joodi, EEM spekter:
EEM spektri iseloomustus: Fluorest-sentsi intensiivsuse maksimum: 21,9, ergastus/ emissioon 230/ 315 nm juures. Fluorestsents praktiliselt puu-dub- see tuleneb asjaolust, et jood toimib proovi molekulide fluorest-sentsi kustutajana. Jood kutsub esile molekulisiseseid energiaüleminekuid, selle tõttu fluorestsentsi intensiivsus väheneb.
Kui lisada joodi lahusesse kaks korda rohkem, siis ta kustutaks fluorest-sentsi veel tõhusamalt ning fluorest- sents poleks arvatavasti tuvastatav- oleks näha vaid ebamäärast arvatava fluorestsentsi hajumist. . . . . .
Samuti, spektraalkujund ei tõesta enam vitamiinivees sisalduva ribo-flaviini olemasolu, kujund on täie-likult paigast nihkunud.
5. Tiamiini EEM spekter:
Tiamiin fluorestseerub. . . . . . . Intensiivsuse maksimumi silmas pidades on fluorestseeruvus pigem vähene, kuid siiski eksisteerib. Fluorestsentsi inten-siivsuse maksimumväärtus: 40,8, ergastus/ emissioon 290/ 320 nm juures.
Tiamiin+ punane veresool (1:1), EEM spekter :
EEM spektri põhjal võib järeldada, et punane veresool kustutas tiamiini fluorestsentsi. Ergastus-emissiooni maatriks on sarnane tiamiinile, aga on selgelt näha, et fluorestsentsi intensiivsus on vähenenud. . . . .
Ergastatud molekulid kannavad energia üle mõnele teisele tundlikuks muudetud molekulile, mis ise seeläbi ergastub ja fluorestseerub ning seetõttu tekivad kujutisele järsud väikesed künkad üle kogu spektri. .... ..... . . .. . . . .
Fluorestsentsi efektiivsust mõjutas asjaolu, et punane veresool ise ei oma fluorestsentsi ning kustutas sellega ka tiamiini fluorestsentsi.
Tiamiin+ punane veresool+ NaOH (1:1:1), EEM spekter :
EEM spektrilt on näha fluorest-seerumist lahusest. Järelikult tiamiini sisaldust lahuses on või-malik määrata aluselistes tingi- mustes . Võrreldes tiamiini stan-dardlahusega on siin joonistunud selgem fluorestsentsspektraalku-jund ning fluorestsents on samuti suurenenud. Intentsiivsuse maksi -mum: 6779,5; ergastuslainepikkusel 365 nm ja emissioonilainepikkusel 445 nm.
6. Hiniin (0,1 mg/L):
Hiniini fluorestsentsi intensiivsuse maksimumväärtus on 26 623,1 (ergastus/emissioon 240/375 nm).
Seega on hiniin väga kõrge fluorestseeruvusega.
Degaseeritud toonik, EEM spekter:
Kuna hiniini fluoresetsentsi segavad toonikus mullid ja happelisus, oli vaja toonik degaseerida. Tooniku pH on 2-3. .- . . . . .
Degaseeritud tooniku fluorestsentsi intensiivsuse maksimum on 24 636 (ergastus/ emissioon 255/ 445 nm), mis näitab kõrget fluorestreeruvust.
Kasutatud toonikuks oli Schweppes’ TonicWater ning see sisaldab hiniini. EEM spektri põhjal võib järeldada, et hiniini kontsentratsioon on väiksem, sest intensiivsus on väiksem, kui hiniini enda EEM spektril.... .
Samuti on kujund veidi paigast nihkunud, mis on tingitud pisut happelisemast keskkonnast.
Kokkuvõte
Katsete tulemustest järeldub, et keskkonna pH mõjutab ainete EEM spektrit. Erinevate ainete tuvastamiseks sobib erinev keskkond- kas aluseline või happeline.
EEM spektrid on iseloomulikud igale ainele, mille abil saab hästi ühendit tuvastada ning ained fluorestseeruvad erineval määral, vastavalt nende molekulaarstruktuurile.