EEM CE-LED protokoll (0)

TTÜ keemiainstituut
Analüütilise keemia õppetool
YKA0040 Lahutusmeetodid keemias
Laboratoorne töö:
EEM/KE-LED
Eri sorti kanepitaimede leotiste uurimine
Õpperühm: YASM11
Teostaja : Ilona Juhanson
Õppejõud: Piret Saar-Reismaa
Teostati : 16.10.15
Fluorestsentsi teooria
Luminestsentsi alla kuulub igasugune valguskiirguse vorm peale kuuma keha kiirgumise. Luminestsentsi korral kaotab süsteem energiat ning kestva kiirgumise korral tuleb energiat väljaspoolt juurde anda. Juhul kui väliseks energiaks on infrapuna , ultravioletne või nähtav valgus, on tegu fotoluminestsentsiga, nagu ka fluorimeetrilises analüüsis .
Fosforestsents on fotoluminestsentsi liik, mis erineb fluosestsentsist seeläbi, et fosforestsentne materjal ei kiirga koheselt välja energiat, mis neeldunud on ning kiirgumine võib toimuda pikema aja vältel, ka peale kiirgusallika eemaldamist.
Fluorestsents on valguse kiirgumine materjali/aine poolt, mis on neelanud valgust või muud elektromagnetkiirgust. Fluorestsents on luminestsentsi liik ning enamasti on kiiratava valgus pikemal lainepikkusel (madalama sagedusega, energiaga) kui neelatud valgus. Huvitav on olukord, mil neeldumine toimub UV-s ning emissioon toimub nähtava valguse piirkonnas. Erinevus fosforestsentsist seisneb selles, et kiirgusallika eemaldamisel ei kesta kiirgumine edasi.
Absorptsioon on neeldumine st nähtus, kus süsteemile antavast energiast osa neeldub.
Emissioon on nähtus, kus osa süsteemile antud, selles neeldunud energiast välja kiirgub.
EEM – ergastus -emissiooni- maatriks
Ramani hajumine on iseloomulik veele (energia neeldub vees), 250 ja 400 nm vahel. Toimub natuke madalam Stokes -i nihe . Põhjus, miks saab määrata kvantitatiivselt – intensiivsuse alusel koostatakse kalibratsiooni graafik ja sealt on võimalik määramispiiride abil saada kogus. Iseloomulik lahustele ning kasutatakse Ramani spektroskoopias, millega saab sarnaselt IR-spektroskoopiale määrata molekuli kuju.
Rayleigh hajumine tuleb sellest, et osa energiast peegeldub, vabaneb. See on elastne valguse või muu elektromagnetkiirguse hajutamine osakeste poolt, mis on kiirguse lainepikkusest väiksemad. Rayleigh hajumine päikesevalguse puhul atmosfääris on tingitud atmosfääris sisalduvatest molekulidest. Kuna Rayleigh hajumine on efektiivsem madalatel lainepikkustel (nähtava valguse spektri sinine piirkond), on suure nurga all maale langev valgus on nähtav sinisena. Tegemist on elastse hajumisega, mis jääb samale lainepikkusele. Kahe Rayleigh piigi vahele peab jääma H2O ala (Ramani hajumine), kui sinna jääb, siis see ei ole tegelikult uuritav aine. Võib ka niisama masinas tekkida.
Stokesi reegel
Fd=6πμRV
Kus Fd on hõõrdejõud [N], mis mõjub vedeliku ja osakese vahele, μ on dünaamiline
viskoossus [Pa*s], R on sfäärilise objekti
raadius [m], V on voolukiirus osakese suhtes [m/s].
Kasutatakse viskoossuse määramiseks .
Fluorestsentsi intensiivsus sõltub järgmistest teguritest:

• pH
  
• Lahuse polaarsus
  
• Temperatuur
  
• Hapniku ja raskemetallide juuresole
  
• Molekuli jäikus
  

• 
  
• 
  

• 
  
• KE teooria:
  
• 
  
• KE pritsiip (liikuvus, EOF) - tehnika, mis väga efektiivselt kasutab väikese läbimõõduga kapillaare eri suuruses molekulide lahutamiseks. Lahutamist võimaldab kõrgpinge kasutamine, mis võib kapillaaris esile kutsuda elektroosmootset ja elektroforeesset voolu puhvrite ja ioonide puhul.
  
• EOF ehk elektroosmootne liikuvus (electroosmotic flow), mis on tingitud kapillaari seina pinnalaengust, defineeritakse valemiga:
  
• 
  
• 
  
• KE erimenetlused – capillary zone electrophoresis, kasutatakse näiteks valkude ja peptiidide lahutamiseks ning võte töötab isegi juhul, kui erinevus lahutatavate ainete vahel seisneb vaid ühes aminohappes. Kapillaar geelelektroforees, geel surub alla EOF-i ning kasutatakse DNA lahutamiseks, kuna lahutamine toimub paremini kui mistahes teisel meetodil. Kasutatakse polüakrüülamiidgeeliga täidetud kapillaare.
  
• Aparatuur - peamisteks osadeks on proov , alg- ja sihtpunkt viaalid/nõud, kapillaar, elektroodid , kõrgpingeallikas, detektor :
  
• Sisestamise eriviisid - elektrokineetiline (analüüdilahus viiakse madalama juhtivusega lahusesse (madalam soola kontsentratsioon), võrrelduna eluendiga) ja hüdrodünaamiline;
  

• 
  
• Elektrokineetiline sisestusviis kujutab endast olukorda, kus kapillaar on asetatud ühest otsast katolüüti ja teisest anolüüti (sisaldab analüüdiga proovi). Pinge rakendamisel EOF liigub kapillaari ühest otsast teise, tekib imemisefekt, mis veab proovi kapillaari sisse.
  
• 
  

• Hüdrodünaamiline sisestusviis töötab rõhu/vaakumi kasutamisel ühest kapillaari otsast. Rõhkude vahe kapillaari otste vahel paneb vedeliku kapillaari sisse liikum . Antud sisestusviisi puhul on olulisteks teguriteks temperatuur ja viskoossus.
  
• 
  
• Detektorid ja nende tööpõhimõtted (vähemalt 4) - tihti kasutatakse UV või UV-VIS neelduvusdetektorit. Sellisel juhul toimib osa kapillaarist detektsioonikohana (ilma polüimiidita "aken") ning mõõdetakse kiirguse neelduvust vastavalt Lambert -Beeri seadusele. Teisena kasutatakse fluorestsentsdetektoreid proovide puhul, mis kas ise fluorestseeruvad või sisaldavad fluorestsentseid markereid (valkude ja DNA puhul, nt), mis puhul mõõdetakse neelduvuse asemel kiirgumist. Massispektromeetried kasutatakse samuti, mispuhul kapillaarist väljuvad ained juhitakse ioonisatsiooniallikasse, mis kasutab ESI-ionisatsiooni. SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy).
  
• 
  
• 
  
• Töövahendid:
  

• Hitachi spektrofluorimeeter F-7000
  
• Kapillaarelektroforees LED-detektoriga
  
• Eri sorti kanepitaimede leotised
  
• Analüüdid ekstraktides: THC, CBD, klorofüll jm taimsed polüfenoolid
  
• THC standard – 10 ppm
  
• CBD standard – 10 ppm
  
• MilliQ vesi
  
• Etanool
  

• 
  
• Töökäik:
  

• Lülitada sisse arvuti, spektrofluorimeeter ja termostaat (tehti eelnevalt)
  
• Käivitada proprgamm FL Solutions 2.1 for F-7000 arvutis (tehti eelnevalt)
  
• Valida FL meetodis vastavad parameetrid (eelnevalt tehtud)
  

• (General: Measurement: 3D Scan , Instrument: Data mode Fluoresence, Ex,Em 200-700 nm, Sampling intrerval 10 nm, Slit 5 nm, Scan speed 12 000 nm/min, PMT Voltage 700 V, Response 0.5 s)
  

• Teha 100x proovide lahjendused (eelnevalt tehtud)
  
• Kasutada 1 ml kvartsküvetti ( pipett seatud 800 μl juurde) ning proovi süstimisel jälgida, et küvett oleks ilma õhumullideta 2/3 täis.
  
• Mõõda esmalt MilliQ EEM
  
• Mõõda teisalt etanooli (lahusti) EEM
  
• Skanneerida proov (Bed Raccoon)
  
• Lahutada proovi EEM-ist etanooli EEM
  
• Hinnata, mitu ained on EEM-is (excitation-emission matrix )
  
• Kopeerida andmed Excelisse edasiseks analüüsiks
  

• 
  
• 
  
• Arvutused:
  
• Arvutada R väärtus piikide X ja CBD ning CBD ja THC vahel. Samuti THC N väärtus.
  
  • Aine/ parameeter
    
  • tm
    
  • Wb
    
  • W1/2
    
  • R
    
  • R
    
  • N
    
  • X
    
  • 5,092
    
  • 5,158-5,008=0,150
    
  • 
    
  • 
    
  • 0,972
    
  • 
    
  • 
    
  • CBD
    
  • 5,250
    
  • 5,350-5,175=0,175
    
  • 
    
  • 
    
  • 3,044
    
  • 
    
  • THC
    
  • 5,833
    
  • 5,958-5,750=0,208
    
  • 0,067
    
  • 
    
  • 41989,82
    
• 
  
• X vs CBD 0,972
  
• CBD vs THC 3,044
  
• NTHC = = 41989,82
  
• 
  
• EEM spektrite tõlgendamine
  
• Standardis (THC, CBD) tipud 275(EX)/300(EM)(CBD) ja 230(EX)/300(EM)(THC)
  
• Uuritud leotis: Bed Raccoon 340(EX)/430(EM), 290(EX)/390(EM) ja 250(EX)/430(EM)
  
• Proov: 100x lahjendatud Bed Raccoon proovis 4 „mäge“/piiki
  
• 275/300 290/380 250/390 230/300
  
• CBD THC
  
• Spektrite järgi otsustades sisaldab töötstuslik CBD-d, kuid mitte THC-d.
  
• Järeldused
  
• Bed Raccoon segus sisalduvad mõlemad, nii CBD kui THC, kuid CBD osakaal on intensiivsuse järgi otsustades suurem, THC-l väiksem.
  
• Teooria, miks CZE (capillary zone electrophoresis) THC ilmub enne CBD-d:
  
• a) Kuna struktuuriline erinevus THC ja CBD vahel seisneb vaid THC puhul heterotsüklis, võrreduna CBD kaksiksideme ja hüdroksüülrühmaga, siis hüdroksüülrühm on happelisem kui hapnik heterotsüklis, andes deprotoneerudes hapnikule negatiivse laengu. Seepärast väljub CBD enne THC-d.
  

• 
  

• 
  
• THC, tetrahüdrokannabinool CBD, kannabidiool
  

• 
  

• Kapillaarelektroforeesi eelised:
  
• Hea lahutusvõime
  
• Väga väikesed proovi kogused
  
• Lahutab nii suuri kui väikeseid molekule
  
• Kiire analüüsi teostamine
  
• Võimalik lahutada nii ioone kui neutraalseid osakesi
  
• Võimalik ühendada ja kombineerida erinevate sisestus- ja detekteerimissüsteemidega
  
• 
  
• Kapillaarelektroforeesi puuduseks on tundlikkus, ehk sarnase massi-laengu suhtega üheneid on keeruline lahutada, see on tundlik pH mõjule ning vajab elektrivälja, mispuhul võivad detektorid mõjutavad analüüsi.
  
• 
  
• EEM eelised:
  
• Kiire analüüs
  
• Suur kontsentratsioonide vahemik
  
• Puudub kokkupuude proovidega (proovid nagu uriin ja veri )
  
• Lihtne teostada
  
• Odav aparatuur
  
• Hea selektiivsus ja tundlikkus
  
• 
  
• EEM puuduseks on põhiliselt see, et ained peavad fluorestseeruma. Samuti on ta väga sõltuv järgmistest parameetritest: temperatuur, pH, ioontugevus. Vajalik on andmebaasi omamine ainete identsifitseerimiseks
  

• 
  
• Lisamaterjalid, mida kasutati
  
• http://microsolvtech.com/cebasic.asp
  
• 
  

6