FLU protokoll (0)

TTÜ keemiainstituut



TalTech keemia ja biotehnoloogia instituut YKA0060  Instrumentaalanalüüs FLU Fluorestsents-spektromeetria Õpperühm: Töö teostaja(d):  Õppejõud:   Töö teostatud (kuupäev):   


1 Töö eesmärk
Töö eesmärgiks oli uurida fluorestsentsi tekitamist, kustutamist ja sõltuvust pH-st. 
Kahe tundmatu joogi koostise iseloomustamine standardainete EEM spektritega 
võrdlemise meetodil. Tooniku hiniini kontsentratsiooni kirjeldamine EEM spektrite 
alusel. 2 Töö käik 1) Destilleeritud vee ja standardainete EEM (excitation - emission matrix)  spektrite mõõtmine ja iseloomustamine, interpreteerimine.  2) Uurimine, kas aine fluorestsents sõltub keskkonna pH-st (püridoksiini ja  riboflaviini näitel).  3) Vitamiinivee EEM spektri mõõtmine ja iseloomustamine, interpreteerimine. 
4) Fluorestsentsi kustutamine (vitamiinivee ja joodi näitel). 
5) Fluorestsentsi tekitamine (aluselises keskkonnas tiamiini ja punase veresoola  näitel).  6) Kvalitatiivne („sõrmejälje“) analüüs EEM spektrit kasutades. 3 Tulemused 3.1 Destilleeritud   vee   ja   standardainete   EEM   (excitation   –   emission   matrix)
spektrite mõõtmine ja iseloomustamine Töö käik:  1) Pesta küvett dest. veega. Pipeteerida küvetti ca 1 ml järgmiseid aineid: o Destilleeritud vesi
o Riboflaviin
o Puridoksiin 2) Asetada küvett ainega masinasse. Valida programmis „Measurements“ , anda  spektrile nime ja vajutada START. Salvestada andmed. Aine Konts, mg/ml Ergastus, nm Emissioon, nm Intensiivsus (max) 1. Destilleeritud vesi - 230 250 240,5 2. Riboflaviin 0,025 370,0 525,0 2579,0 3. Puridoksiin 0,022 325,0 390,0 4422,1 Tulemuste kirjeldus ja analüüs:  Vesi ei fluorestseeru, EEM spektri maksimum on tingitud Ramani hajumisest.  Puridoksiin ergastub ja emiteerib footoneid lühematel lainepikkustel (võrreldes  riboflaviiniga) ning selle fluorestsents on intensiivsem.


Joonis 1. Destilleeritud vee EEM spekter Joonis 2. Riboflaviini EEM spekter Joonis 3. Puridoksiini EEM spekter Ramani hajumine


3.2 Uurimine,   kas   aine   fluorestsents   sõltub   keskkonna   pH-st   (püridoksiini   ja
riboflaviini lahused neutraalses happelises ja aluselises keskkonnas) Töö käik:  1) Mõõta järgnevate lahuste EEM spekter: a. Riboflaviin + 1ml sidrunhape (ca 2 mM)
b. Riboflaviin + 1 ml NaOH (5 mM)
c. Puridoksiin + 1ml sidrunhape (ca 2 mM)
d. Puridoksiin + 1 ml NaOH (5 mM) Lahus Konts, mg/ml pH Ergastus, nm Emissioon , nm Intensiivsu s (max) 1. Riboflaviin  0,025 neutr. 370,0 525,0 2579,0 2. Riboflaviin + 
sidrunhape 0,0125 2 365,0 525,0 1742,9 3. Riboflaviin + 
NaOH 0,0125 9 365,0 530,0 289,0 4. Puridoksiin 0,022 neutr. 325,0 390,0 4422,1 5. Puridoksiin + 
sidrunhape 0,011 2 290,0 390,0 3922,5 6. Puridoksiin + 
NaOH 0,011 9 310,0 370,0 3847,6 Tulemuste kirjeldus ja analüüs:  Riboflaviini puhul kustutas aluseline keskkond fluorestsentsi tunduvalt. Happeline  keskkond vähendas umbes poole võrra. Puridoksiini puhul oli fluorestsentsi  kustutamine mitte nii väga intensiivne ning happelises ja aluselises keskkonnas umbes sama. Kuid aga muutusid ergastuse ja emissiooni lainepikkused väiksemaks. Järeldus: erinevate ainete fluorestsentsi ergastuse/emissiooni lainepikkus ja  intensiivsus sõltub keskkonna pH-st. Joonis 4. Riboflaviini EEM spekter happelises (vasakul) ja aluselises (paremal) keskkonnas


Joonis 5. Puridoksiini EEM spekter happelises ja aluselises keskkonnas. 3.3 Vitamiinijoogi EEM spektri mõõtmine ja iseloomustamine Töö käik:  1) Pipeteerida 1 ml vitamiinijooki küvetti ja mõõta EEM spekter. Aine Konts,  mg/ml Ergastus, nm Emissioon, nm Intensiivsus (max) 1. Vitamiinijook - 365,0 530,0 289,0 2. Riboflaviin (B2) 0,025 370,0 525,0 2579,0 3. Puridoksiin (B6) 0,022 325,0 390,0 4422,1 Tulemuste kirjeldus ja analüüs:  Vitamiinijoogi EEM spekter (vt. joonis 6) on sarnane puridoksiini omaga (vt. joonis  3), seega võib oletada, et pudelis esineb puridoksiini ehk B6 vitamiini. Pudeli peal  olev joogi koostis seda ka kinnitab (vt. joonis 6).


Joonis 6. Vitamiinijoogi EEM spekter ja pudeli toitumisalane teave. 3.4 Fluorestsentsi kustutamine (vitamiinivee ja joodi näitel) Töö käik: 1) Lisada eelmises katses kasutatud vitamiinijoogiga küvetti 2 tilka joodi.
2) Mõõta EEM spekter. Aine Ergastus, nm Emissioon, nm Intensiivsus (max) 1. Vitamiinijook 365,0 530,0 289,0 2. Vitamiinijook +
jood 230,0 310,0 23,2 Tulemuste kirjeldus ja analüüs:  Jood kustutas fluorestsentsi. Kui lisaksime joodi 2 korda rohkem, kaduks fluorestsents täielikult ning spekter oleks tume. Joonis 7. Vitamiinijoogi EEM spekter enne ja
pärast joodi lisamist. 3.5 Fluorestsentsi tekitamine (aluselises keskkonnas tiamiini ja punase veresoola 
näitel). Töö käik: 1) Pipeteerida küvetti 1 ml tiamiini lahust (0,25 mg/mL). Mõõta EEM spekter.
2) Lisada samasse küvetti tiamiinile 1 ml punase veresoola (edaspidi „PVS“)  lahust ja segada. Mõõta EEM spekter. 3) Lisada samasse küvetti 1 ml NaOH lahust (5 mM) ja segada. Mõõta EEM  spekter. 4) Mõõta 1 ml NaOH (5 mM) + 1 ml tiamiin (0,25 mg/mL) EEM spekter. Aine Ergastus, nm Emissioon, nm Intensiivsus (max) 1. Tiamiin 230,0 380,0 54,6 2. Tiamiin + PVS 240,0 365,0 29,4 3. Tiamiin + PVS  365,0 435,0 4855,2


+ NaOH
4. Tiamiin + 
NaOH 300,0 335,0 19,8 Tiamiini fluorestseerumiseks tuleb seda täielikult oksüdeerida. Aluselises lahuses  muutub mittefluorestseeruv tiamiin K-ioonide mõjul sinist valgust emiteerivaks  tiokroomiks. Fluorestsents tekkimine on tingitud sellest, et molekuli struktuur muutus  jäigemaks ja stabiilsemaks. Tulemuste kirjeldus ja analüüs:  Tiamiinile punase veresoola lisamisel emiteeritud valguse intensiivsus vähenes.  Samuti oli ka NaOH lisamisel tiamiinile. Tiamiini, NaOH ja punase veresoola  segamisel oli tulemuseks tugev fluorestsents. Joonis 8. Tiamiini ja tiamiin+PVS EEM spekter Joonis 9. Tiamiin+PVS+NaOH ja tiamiin+NaOH EEM spekter


3.6 Kvalitatiivne („sõrmejälje“) analüüs EEM spektrit kasutades Töö käik: 1) Degaseerida toonik ultrahelivannis.
2) Mõõta ettevalmistatud hiniini lahuse (0,1 mg/mL) EEM spekter.
3) Mõõta kahe tundmatu proovi EEM spektrid.
4) Mõõta kahe proovi pH, pH indikaatorpaberit kasutades, ning vastavalt  tulemusele lisada hiniinile kas hapet või alust. 5) Mõõta happelise/aluselise hiniini EEM spekter. Aine Konts. mg/ml Ergastus, nm Emissioon, nm Intensiivsus (max) 1. Hiniin 0,1 mg/ mL 235,0 380,0 11413,6 2. Hiniin + sidrunhape 0,05 mg/ mL 250,0 455,0 10351,3 3. Jook 1 - 285,0 310,0 342,9 4. Jook 2 - 250,0 455,0 7928,6 Happelise hiniini (0,05 mg/mL) fluorestsentsi intensiivsus on 10351,3; Jook2 oma  7928,6.  0,05 / x = 10351,3 / 7928,6 x = 0,038 mg/mL Jook 2 sisaldab umbes 0,038 mg/mL hiniini. Tulemuste kirjeldus ja analüüs:  Jookide pH=3, seega tuleb hiniin hapestada 1ml sidrunhappega (ca 2mM). Võrreldes  happelise hiniini EEM spektri Jook1 ja Jook 2 omadega (vt. joonised 10,11) selgub, et hiniini sisaldub Joogis nr 2 (toonikus), kuna spektrid on sarnased. Joonis 10. Neutraalse ja happelise hiniini EEM spektrid.


Joonis 11. Jook1 ja Jook 2 EEM spektrid. 4 Kokkuvõte ja järeldused Töö   käigus   järeldati,   et   ainete   fluorestsentsi   intensiivsus   sõltub   keskkonna   pH-st. EEM spektrite põhjal sisaldub vitamiinijoogis riboflaviini ehk B6 vitamiini.  Uuriti fluorestsentsi kustutamist halogeeni (antud töös joodi) näitel ja fluorestsentsi tekitamist tiamiini näitel. Selgus, et tiamiini fluorestsentsiks on seda vaja alustelistes tingimustes täielikult oksüdeerida, et tekiks jäigem ja stabiilsem tiokroomi vorm. Hiniini avastati Joogis nr 2 ning selle kontsentratsiooniks saadi 0,038 mg/mL. 5 Tagasiside antud töö kohta (pole kohustuslik) Praktilise töö juures oli kõik hästi ja lihtsalt selgitatud. Kõige raskem oli leida ja aru  saada, kuidas tekib tiamiini puhul fluorestsents.

Document Outline

• 1 Töö eesmärk
• 2 Töö käik
• 3 Tulemused
  • 3.1 Destilleeritud vee ja standardainete EEM (excitation – emission matrix) spektrite mõõtmine ja iseloomustamine
  • 3.2 Uurimine, kas aine fluorestsents sõltub keskkonna pH-st (püridoksiini ja riboflaviini lahused neutraalses happelises ja aluselises keskkonnas)
  • 3.3 Vitamiinijoogi EEM spektri mõõtmine ja iseloomustamine
  • 3.4 Fluorestsentsi kustutamine (vitamiinivee ja joodi näitel)
  • 3.5 Fluorestsentsi tekitamine (aluselises keskkonnas tiamiini ja punase veresoola näitel).
  • 3.6 Kvalitatiivne („sõrmejälje“) analüüs EEM spektrit kasutades
• 4 Kokkuvõte ja järeldused
• 5 Tagasiside antud töö kohta (pole kohustuslik)