esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht Vxmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse väljumad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on ligilähedane kolonni kogumahule Vxmax Vt . Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedelikku maht ületab kolonni kogumahtu. Töö käik. Kolonni tätmine ja iseloomustamine Täidetud kolonnile arvutatakse geelisamba kõrguse ja diameetri alusel täidise kogumaht Vt Geelisamba kõrgus = 31cm Sissediameeter = 1,8cm Vt = r2h = 3,14*0,92*31= 78,85 cm3 Vastavalt kolonni täitematerjalli iseloomustava teguri k väärtusele leitakse geelimatriksi maht V g k = 0.1 Vg = k*Vt = 0,1* 78,85 = 7, 885 cm3 Geelimatriksi mahust lähtuvalt leiame antud kolonnile iseloomulik maksimaalne elueerimismaht V xmax Vxmax =Vt-Vg = 78.85 7,886 = 70,96 cm3
võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse väljumad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on ligilähedane kolonni kogumahule Vxmax Vt . Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedelikku maht ületab kolonni kogumahtu. Töö käik. Kolonni tätmine ja iseloomustamine Geel: Sefadex 6-50 Täidetud kolonnile arvutatakse geelisamba kõrguse ja diameetri alusel täidise kogumaht Vt Geelisamba kõrgus = 31cm Sissediameeter = 2,0 cm Vt = r2h = 3,14*12*31= 97,34 cm3 Vastavalt kolonni täitematerjalli iseloomustava teguri k väärtusele leitakse geelimatriksi maht Vg k = 0.1 Vg = k*Vt = 0,1* 97,37 = 9,734 cm3 Geelimatriksi mahust lähtuvalt leiame antud kolonnile iseloomulik maksimaalne elueerimismaht Vxmax Vxmax =Vt-Vg = 97.37 9,734 = 87,6= 88 cm3 Kui fraktsioonide mahuks võtta 2 ml, siis peaks kokku saama 88/2=44 fraktsiooni. Kromatografeerimissüsteemi koostamine
Kolonn on statiivi küljes ning selle alla peab mahtuma katseklaas. Täidise kõrgus on tavaliselt 25-30 cm ja täidise kohal on tavaliselt 3-4 cm eluendi kiht. Ainete kontsentratsioonide kindlaks määramiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. Katse käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kolonni täidis: Sephadex G-75, mis on dekstraantäidis, fraktsioneerimispiirkonnaga 3000- 80000 daltonit. Kolonni iseloomustav tegur k=0,1 Geelisamba kõrguseks mõõtsin: L=18 cm Geelisamba diameetriks mõõtsin: d=2,8 cm r=1,4 cm Arvutan täidise kogumahu: Vt=r2**L Vt=1,42*3,14*18=110,78 cm3 Arvutan geelimaatriksi mahu: Vg=k*Vt Vg=0,1*110,78=11,08 cm3 Arvutan maksimaalse elueerimismahu: Vxmax=Vt-Vg Vxmax=110,78-11,08=99,7 cm3 Ühe fraktsiooni maht: 2 mL Arvutan fraktsioonide üldarvu: n=Vxmax/2 n=99,7/2=49,85=50 fraktsiooni. Asetasin katseklaasistatiivi vastavalt fraktsioonide üldarvule 50 katseklaasi, mis olid
Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. · Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k. · Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. · Arvutatakse täidise kogumaht Vt · Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax / 2. · Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. · Märgitakse üles voolutuslahus ja varustatakse end sobiva pipetiga, millega saab lahust kolonni lisada.
Et täidis väja ei voolaks, on kolonni alumine ots täidetud klaasvillaga. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainehulkade kindlakstegemiseks kogutud fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine 1. Kontrollitakse, et kolonn oleks vertikaalne. 2. Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark ja seda iseloomustav tegur k. 3. Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja ja diameeter d. 4. Arvutatakse täidise kogumaht Vt 5. Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav 6. maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt - Vg 7. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega 8. n = Vxmax / 2. 9. Statiivi pannakse vajalik kogus kalibreeritud ja nummerdatud katseklaase. 10
kolonnist väljuma. Seejärel asun kolonni voolutama, et ained kanduksid koos voolutiga läbi kolonni katseklaasidesse. Siis asun fraktsioone analüüsima, et saada teada erineva mahuga väljunud fraktsioonide ainete sisaldust (fraktsioonide optilise tiheduse kaudu). Geelkromatograafiakolonni iseloomustavad mahud · Töö käik etappide kaupa Kõigepealt iseloomustasin kolonni ja valmistasin selle ette: o Kontrollisin kolonni vertikaalsust, geelisamba vertikaalsema piiri saamiseks sai seda loksutatud ning lastud sellel uuesti settida. o Märkisin ülesse kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i margi Sephadex G-75 ja seda iseloomustava teguri k=0,1. o Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrguse l=32 cm ja diameetri d=1,6 cm, kasutades sobivat joonlauda. o Arvutasin täidise kogumahu Vt = Vv + Vs + Vg = PI*(d/2)2*l = 64 cm2.
oli 0,1. Vastavalt valemitele arvutasin: 2 1,8 Vt = * * 31,4 = 79,86cm 3 2 V g = k * Vt = 7,986 V x max = 79,86 - 7,986 = 71,874 71,874 n= = 35,957 36 2 Sain siis, et fraktsioonide üldarvuks tuleb 36. Seejärel eemaldasin kolonni ülaosast üleliigse vedeliku lastes sel voolata mööda kolonni väiksesse keeduklaasi. Kui vedeliku nivoo oli geelisambaga peaaegu samal kõrgusel ( umbes 2mm kõrgemal) siis sulgesin kraani ja doseerisin pipetiga geelisamba pinnale 0,5ml uuritavat proovi. Proov koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin ja DNA-aspartaat. Seejärel keerasin kraani vaikselt tilkuma ja panin sinna alla kolvi. Kui uuritav proov oli geeli imendunud, lisasin natuke juurde puhvrit, seejärel uuesti väikese koguse ja lõpuks lisasin rohkem, et puhvri maht ulatuse kolonni ääreni. Lasin eluaadil kolbi tilkuda seni, kuni esimene värviline riba ( sinine) jõudis kolonni põhjani ja
4. Lisasin puhverlahust, seni kuni sinine värvus kolonnis oli jõudnud peaaegu väljavooluni. Kogusin fraktsiooni mõõtekolbi. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused: Geelisamba kõrgus: 31cm Diameeter: 2cm, raadius=1cm, seega kolonni maht: 3,14x31=97,34 k=0,1 geelimaatriksi maht Vg= 0,1x97,34= 9,734 ml Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax= Vt-Vg: 97,34-9,734= 87,6ml Fraktsioonide üldarv n= 2ml n= Vxmax/2 =87,6/2= 43,8 Kokku tuli 50 fraktsiooni, igaühes 2ml proovi, mõõtekolvis oleva vedeliku maht: 29 ml, seega teeb kokku 50x2= 100+29=129 ml Vx= 29ml Rf=29-97,34/87,6-97,34=7,016 Proovide optilised tihedused: Lainepikkus 670 nm (sinine) 1- 0 2- 0 3- 0,066
kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. Vxmax = Vt - Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on kindlaks määratus, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = Vx Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik · Kontrollitakse kolonni vertikaalsust · kolonni täidis: Sephadex G-75, tegur k = 0,1 · geelisamba kõrgus l = 31,4 cm · diameeter d = 1,6 cm · täidise kogumaht Vt = 63 ml · geelimaatriksi maht Vg = 0,1 63 = 6,3 ml · maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 63 6,3 = 56,7 ml · fraktsioonide üldarv n = 56,7 / 2 = 29 · statiivi võetakse vastav arv katseklaase · eluendi koostis: 50nM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH = 7,5 · uuritav segu: o dekstraansinine (6mg/ml) o müoglobiin (6mg/ml)
TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Õppeaine YKL0063 Biokeemia PRAKTIKUM: Ainete segu lahutamine geelkromatograafia meetodil Üliõpilane: Juhendaja: Kood: Esitatud: Sooritatud: 2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL Teooria Geelkromatograafia põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende erinevate molekulmasside järgi. Lahuses sisalduvad ained liiguvad läbi geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. Proov viiakse läbi kolonni vesilahuse abil. Geelkromatograafia protsess toimub kolonnis, mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromo...
Kogu protsess viiakse läbi kolonnis. Kogu protsessei käigus on võimalik teha kindlaks iga aine elueerimis- ehk väljumismaht. See on selline elulaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Esmalt märkisime üles Sephadex’i margi=> 675 ja seda iseloomustava teguri k=>0,1. Seejärel mõõdetakse geelisamba kõrgus L=>12,5 cm ja ja diameeter d=>2,7 cm. Arvutatakse täidise kogumaht Vt=>71,53 Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt=>7,15 ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vx max = Vt – Vg=>64.38. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2=>32,19. Katseklaasistatiivi asetatakse fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml)
peaaegu väljavooluni. Kogutud eelfraktsiooni mahu mõõtsin mõõtsilindri abil. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused: Geelisamba kõrgus: 17,8cm Diameeter: 2,4cm, raadius=1,2cm, seega kolonni maht: Vt=3,14x1,22x17,8=80,53 ml pundumistegur k=0,1 geelimaatriksi maht Vg= 0,1x80,53=8,053 ml Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax= Vt-Vg=80,53-8,053=72,477 ml Fraktsioonide(2ml) üldarv n= Vxmax/2 =72,477/2=36,24 ~36 Kokku võtsin 34 fraktsiooni, igaühes 2ml proovi, mõõtekolvis oleva eeljooksu maht: 24 ml, seega teeb kokku 34x2= 68+24=92 ml
Liikuvustegurit Rf kasutatakse nende ainete iseloomustamiseks, mis suudavad geeli pooridesse difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm r= 0,8 cm Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP-aspartaat 0,3mg/ml Arvutasin välja: Vt = r2 * L= 3,14 * 0,64 * 25,5 = 51,27 cm3 Vg= k*Vt = 0,1 * 51,27 = 5,127 ml Vx max = Vt Vg = 51,27 5,127 = 46,143 ml N= Vx max /2 = 46,143 /2 = 23,1 tk Pärast ettevalmistuste tegemist avada ettevaatlikult kolonni voolutusava ning kui vedeliku tase
geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt. Vxmax = Vt Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik: Kolonn ja selle ettevalmistamine: · Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75 k=0,1. · Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 32,2 cm ja diameetri d 1,9 cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = 91,296. · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 9,1296 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse
elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf Rf = Kromotogramm-kromotograafia protsessi visuaalne väljund, see on graafiline sõltuvust eluaadi fraktsioonides sisuldava aine kontsentratsioon ja eluaadi mahu vahe. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kolonn nr.1.Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Joonlauda abiga mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 17,4 cm ja diameetri D = 2,8 cm. Arvutasin täidise kogumahu Vt = = 76,49 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k Vt = 7,65 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t) Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5,
elueerimismaht on antud kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = (Vx Vxmin)/(Vxmax Vxmin) , kus 0 < Rf < 1 Fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammi. Käesolevas töös kasutatakse konstentratsioonide kindlakstegemisel spektrofotomeetrilist meetodit. Töö käik Antud töös kasutan Sephadex G-75 geeli, mille k=0,1. Mõõdan geelisamba kõrguse L=15,5 cm ja sisediameetri d=2,7 cm. Siit saan arvutada geelitäidise kogumahu Vt. d Vt = S p × L = × ( 2 )2 × L 2,7 cm Vt = × ( 2 )2 × 15,5 cm = 88,7 cm3 Siit saan arvutada geelimaatriksi mahu Vg. Vg = k × V t Vg = 0,1 × 88,7 cm3 = 8,87 cm3 = 8,9 cm3 Ning kolonni maksimaalse elueerimismahu Vxmax Vxmax = Vt - Vg Vxmax = 88,7 cm3 8,9 cm3 = 79,8 cm3
Ühendatud fraktsiooni mahu mõõtsin pärast. Alustasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Elueerimise lõpetasin, kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsisin spektrofotomeetri abil. Igal ainel oli oma neeldumismaksimum. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrdusid 0-ga ja neid polnud vaja mõõta. Tulemused: · Kolonni täidiseks on Sephadex'i G-75, iseloomustav pundumistegur k on 0,1 · Geelisamba kõrgus L=33 cm ja diameeter d=1,6 cm · Täidise kogumaht Vt=L** =33* * =66,35 ml · Geelimaatriksi maht Vg = k · Vt=0,1*66,35=6,635 ml maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg= 66,35-6,635=59,715 ml · Fraktsioonide üldarv n, ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax/2=59,715/2=30 · Elueerimislahus 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl pH 7,4 Optiline Elueerumismaht
molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema. Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf. Rf = (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin) Aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nim. kromatogrammiks. Töö käik Kolonni iseloomustavad parameetrid: Kasutatav geel: Sephadex G-75 Geeli pundumisaste k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 17 Täidise diameeter d= 2,5; r = 1,25 Täidise kogumaht Vt= П*r2*L => 3,14* 1,252*17=83,41 Geelimaatriksi maht Vg= K*Vt => 0,1*83,41=8,341 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg => 83,41-8,341 = 75,069 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/2 => 42,84/2 = 37,5 Katseklaasistatiivi asetati 38 katseklaasi nummerdatult. Seejärel avati kolonni väljavooluava ja reguleeriti kiirus optimaalseks (2 ml fraktsiooni kogumiseks kulub 2-3 minutit). Kui
vaheline graafiline sõltuvus. Töö käik Kolonni iseloomustramine ja ettevalmistamine: · Kontrollin kolonni vertikalsust. On vertikaalne. · Märgin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k , mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest. Sephadex G-75, pundumistegur k= 0,1. · Mõõden geelisamba (täidise) kõrgus L ja diameeter d, kasutades sobiva joonlauda. L=32,5 cm. d=1,9 cm. · Arvutan täidise kogumaht Vt . · Arvutan geelimaatriksi maht Vg . · Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml. n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42 · Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan.
V x −V min x Rf = V max−V min x x Kromotogramm - kromotograafia protsessi visuaalne väljund, see on graafiline sõltuvust eluaadi fraktsioonides sisuldava aine kontsentratsioon ja eluaadi mahu vahe. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Tööd teostasin kolonni juures nr 2. Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 23,3 cm ja diameetri D = 1,6 cm. Arvutasin 2 täidise kogumahu Vt = π ∙ r ∙ L = 0,82*23,3* π =46,85 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k ∙ Vt = 0,1*46,85= 4,685 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 42,162 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 42,165/2≈21.
kogumine toimub käsitsi. Valemid ja nendes kasutatavad lühendid Täidise maht (Vt) Kolonni vaba maht, s.o graanulitevahelise vedeliku maht (Vv) Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) Geelmaterjali (maatriksi) maht (Vg) Valem täidise mahu arvutamiseks: Vt=Vv+Vs+Vg Liikuvustegur Rf: Töö käik Pärast kolonni vertikaalsuse kontrollimist märgitakse üles täidiseks oleva Sephadex´i mark ja tegur k ning uuritava lahuse ja voolutuslahuse koostis. Mõõdetakse geelisamba kõrgus L ja diameeter d. Arvutatakse täidise kogumaht Vt, geelmaatrikis maht Vg = k·Vt ning maksimaalne elueerimismaht Vxmax=Vt Vg. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n (võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml) n = Vxmax/2. Nummerdatakse vajalik arv (n) kalibreeritud katseklaase. Avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus lastakse voolata kolonni kuni vedeliku tase langeb täidise pinnani, siis suletakse väljavooluava.
molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvus-teguriga Rf, mille väärtus jääb vahemikku 0...1. Rf= (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin) Aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nim. kromatogrammiks. Töö käik Kolonni iseloomustavad suurused Kasutatav geel Sefadex G-75 Pundumistegur k=0,1 Geelisamba kõrgus L= 29,5 cm Kolonni sisediameeter 2,1 cm ( r= 1,05 cm) Vajalikud arvutused tööks Kogumaht Vt= Sp * L Sp= r2 Vt= 3,14 * (1,05)2 * 29,5 = 102 cm3 Geelimaatriksi maht Vg= k* Vt Vg= 0,1* 102 = 10,2 cm³ Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg Vxmax= 102-10,2= 91,8 cm3 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/ 2 n= 91,8/246 katseklaasi Elueerimispuhver: 0,15 M NaCl; 20 mM Tris/HCl; pH= 7,5
geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt. Vxmax = Vt Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik Kolonn ja selle ettevalmistamine: · Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex fine G-75 k=0,1. · Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 16,8 cm ja diameetri d = 2,7 cm r= 1,35cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = L·r2 = 114,45 · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 11,44 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse
täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas. Täidise krgus kolonnides on 2530 cm. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutati spektrofotomeetrilist meetodit. TÖÖ KÄIK Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine kolonni täidis Sephadex G75, k=0,1 Geelisamba täidise kõrgus L=24 cm, diameeter d=2 cm Täidise kogumaht Vt = ·(d:2)2·L = 3,14· (2:1)2·24 = 75,40 cm3 = 75,40 ml Geelimaatriksi maht Vg = k·Vt = 0,1·75,40 = 7,54 ml, kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg = 75,407,54 = 67,86 ml. Fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; n = V xmax/2 = 67,86/2 = 33,93. Avasin kolonni vooluava ning täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt mööda kolonni liikuma
automaatne fraktsioonide kogumine. Töö käik: Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja vajadusel korrigeerisin kolonni asendit. · Märkisin ples kasutatava kolonni täidiseks oleva Serphadex'i margi ja seda iseloomustava teguri k. Sephadex'i mark: Tegur k: · Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrguse L ja diameetri d. Täidise kõrgus: Täidise diameeter: · Arvutasin täidise kogumahu . · Arvutasin geelmaatriksi mahu ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu . · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml. · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerasin.
kasutatava geeli pooridesse ja, mille elueerimismaht on kolonnis kindlaks määratud. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline sõltuvus. 2. Töö käik 1.3 Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Märkisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i margi ja seda iseloomustava teguri k. Sephadex'i mark: G-75 k = 0,1 Mõõtsin geelisamba ehk täidise kõrguse L ja diameetri d, kasutades sobivat joonlauda. L = 17,6 cm d = 3 cm Arvutasin täidise kogumahu Vt. Vt = L * r2 * = 17,6 * 1,52 * = 124,4 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueelirimismahu Vxmax = Vt - Vg Vg = 0,1 · 124,4 cm3 = 12,44 cm3 Vxmax = 124,4 cm3 12,44 cm3 = 111, 96 cm3 Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2ml; seega
Eluendi lisamine kolonni ja fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Antud töös kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. Töö käik: Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine ·Kontrollisin kolonni vertikaalsust, asendit korrigeerida polnud vajalik. ·Kolonnis oleva Sephandex'i mark: Sephandex G75 fraktsioonimispiirkond 3000-80000 D, k=0.1 (väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest) ·Mõõtsin geelisamba kõrguse L ja diameetri,kasutades sobivat joonlauda.n L=28cm; d=2.2cm. ·Arvutasin täidise kogumahu Vt= r 2 *L= *1.1²*28=106 cm³ ·Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg=k*Vt=0.1*106=10.6 ja sellest lähtuv kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimistmaht Vx;max=Vt-Vg=106-10.6=95.4 ·Arvutasin fraktsioonide üldarvu, arvestan kindlaks mahuks 2ml. n=Vx;max/2=95.4/2=47.7. (Kuigi selline arvutus, läks mul vaja 36 katseklaasi).
Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse käesolevas töös spektrofotomeetrilist meetodit Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollisin kolonni vertikaalsust. · Märgisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k, mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest ning sain teada et see on võrdne 0,1-ga. · Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrgus L ja ja diameeter d, kasutades sobivat joonlauda. Sain, et L=31cm ja d=1,8 cm · Arvutasin täidise kogumaht Vt Selleks, et leida kogumahu, tuleb esiteks leida aluse pindala: S = r2 = · 0,92 2,54cm2 Ning arvutasin kogumaht: Vt = S · L = 2,54 · 31 78,74cm3 · Arvutasin geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg: Vg = 0,1 · 78.88 = 7,87 cm3 Vxmax = 78,74 7,87 = 70,87cm3
töös spektrofotomeetriat. 2.1.1.1 Töö käik Antud töös aga automaatset kromatografeerimissüsteemi ei kasutata ning fraktsioonid kogutakse käsitsi. KOLONNI ISELOOMUSTAMINE JA ETTEVALMISTAMINE: 1. Kontrollin, et geelkromatograafia kolonn asuks täpselt vertikaalselt ning sobival kõrgusel. 2. Kolonni täidiseks on Sephadex G-75 ja seda iseloomustav, geeli pundumisastmest sõltuv tegur k = 0,1. 3. Mõõdan geelisamba kõrguse ja diameetri L = 17,8 cm d = 2,7 cm 4. Arvutan täidise kogumahu Vt = = 3,14 5. Arvutan geelimaatriksi mahu Sellest lähtuvalt saab leida kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu 6. Arvutan fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml, mistõttu 7. Asetasin statiivi umbes 35 katseklaasi (kuigi arvutused näitasid, et vaja oleks 45) 2 ml
Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse käesolevas töös spektrofotomeetrilist meetodit Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollisin kolonni vertikaalsust. · Märgisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k, mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest ning sain teada et see on võrdne 0,1-ga. · Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrgus L ja ja diameeter d, kasutades sobivat joonlauda. Sain, et L=31cm ja d=1,8 cm · Arvutasin täidise kogumaht Vt Selleks, et leida kogumahu, tuleb esiteks leida aluse pindala: S = r2 = · 0,92 2,54cm2 Ning arvutasin kogumaht: Vt = S · L = 2,54 · 31 78,88cm3 · Arvutasin geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg: Vg = 0,1 · 78.88 = 7,89 cm3 Vxmax = 78,88 7,89 = 70,99cm3
käesolevas töös spektrofotomeetrilist meetodit (vt 2B. Spektroskoopilised meetodid). Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollitakse kolonni vertikaalsust ja vajadusel korrigeeritakse kolonni asendit. · Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda ise- loomustav tegur k, mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest. · Mõõdetakse geelisamba (täidise) kõrgus L ja ja diameeter d, kasutades sobivat joonlauda. NB! Täidise diameetri mõõtmine eeldab kolonni sisediameetri võimalikult täpset määramist nihkkaliibri või joonlaua abil. · Arvutatakse täidise kogumaht Vt. · Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg. · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega
annaabi.ee 
